Номер части:
Журнал
ISSN: 2411-6467 (Print)
ISSN: 2413-9335 (Online)
Статьи, опубликованные в журнале, представляется читателям на условиях свободной лицензии CC BY-ND

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ И СТЕХИОМЕТРИИ НЕКОТОРЫХ БИОАНТИОКСИДАНТОВ ДВУМЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМИ МЕТОДАМИ



Науки и перечень статей вошедших в журнал:
DOI:
Дата публикации статьи в журнале:
Название журнала: Евразийский Союз Ученых — публикация научных статей в ежемесячном научном журнале, Выпуск: , Том: , Страницы в выпуске: -
Данные для цитирования: . ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ И СТЕХИОМЕТРИИ НЕКОТОРЫХ БИОАНТИОКСИДАНТОВ ДВУМЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМИ МЕТОДАМИ // Евразийский Союз Ученых — публикация научных статей в ежемесячном научном журнале. Химические науки. ; ():-.

В настоящее время широко используются хемилюминесцентные (ХЛ) методы определения антиоксидантной активности (АОА) различных биологических субстратов: плазмы крови, всевозможных напитков, экстрактов растений и пр. [1, 5, 11-12]. Они достаточно чувствительны, оперативны и позволяют непосредственно контролировать кинетику ингибирования окисления антиоксидантами. Основными компонентами любой ХЛ модели являются: система генерации свободных радикалов и субстрат или молекула-мишень, при окислении которой возникает хемилюминесценция. Выбор модельной системы оказывает существенное влияние на получаемые результаты исследований АОА различных объектов. Большое количество ХЛ методов, широко используемых в органической химии, основано на инициированном окислении различных углеводородов, в результате рекомбинации перекисных радикалов которых образуются возбужденные молекулы соединений, испускающие свет. В таких системах для усиления свечения используются разные активаторы-люминофоры, а эффективное окисление протекает при температурах 50-800С [2, 4, 13]. В других методах, применяемых, главным образом, для медико-биологических исследований, в качестве хемилюминогенного субстрата окисления используется, в основном, люминол [3, 6-7, 9-10, 14-15]. Способ генерации радикалов в таких, относительно простых тест-системах, осуществляется по разным принципам: химическому (например, при взаимодействии гем-содержащих производных с перекисью водорода) или физико-химическому (при термоинициированном распаде азо-соединений). Чтобы выбрать наиболее адекватную и удобную модель окисления люминола для определения АОА сложных биологических субстанций, таких как сыворотка крови и другие биологические жидкости, экстракты растений, лекарственные препараты и пр., целесообразно сравнить антиоксидантные свойства и стехиометрию индивидуальных соединений, содержащихся в этих субстанциях, используя разные системы генерации свободных радикалов.

В настоящей работе на двух ХЛ моделях свободнорадикального окисления люминола проведены исследования антиоксидантной активности (АОА) и стехиометрии некоторых биологически значимых АО и влияния на эти параметры способа инициирования свободных радикалов. В качестве объектов исследования были выбраны водорастворимые соединения: мочевая кислота (МК), глутатион, аскорбиновая кислота (АК), мексидол (м), фенозан калия (ф), а также тролокс (водорастворимый аналог витамина Е), как часто используемый в различных методах в качестве стандарта.

Измерения АОА этих соединений были выполнены на двух ХЛ приборах: в первом окисление люминола инициировалось смесью «гемоглобин (Hb)-H2O2», во втором – водорастворимым азоинициатором (АБАП).

Первая модель окисления (Hb — H2O2 – люминол), хотя и не до конца изучена, привлекает внимание «физиологичностью» процесса, поскольку кровь содержит Hb и H2O2, и их взаимодействие может происходить in vivo [14]. Взаимодействие H2O2 с MetHb (в лабораторной практике используется окисленная форма гемоглобина — метгемоглобин (MetHb) – Hb-Fe3+), с одной стороны, сопровождается разрушением гема и выходом из него ионов железа, которые участвуют в образовании ОН·, а с другой стороны, приводит к возникновению радикалов феррилHb (Hb·+-Fe4+=O). Указанные радикалы-инициаторы вызывают одноэлектронное окисление люминола. В процессе его окисления образуется L·-радикал, О2·, эндопероксид люминола LO22 и 3-аминофталат дианион в возбужденном состоянии (АР2)*, при переходе которого в основное состояние высвечивается квант света hν с длиной волны 425 нм. Преимущество модели: все реагенты доступны и не токсичны. Ограничения: нестабильность H2O2 и необходимость контроля ее концентрации. ХЛ для этой модельной системы регистрировали на приборе «Lum-5773» [www.chemilum.ru] при температуре T=37,0±0,5°С согласно методике [14]. В ячейку прибора добавляли 50мкл MetHb (15мкМ), 150мкл люминола (1мМ), 10мкл H2O2 (12мМ), 2,4мл фосфатного буфера (рН=7,4) и разные дозы исследуемых АО (от 0,1 до 60 мкл) с концентрацией 1мМ, растворенные в буфере или дистиллированной воде. Это: тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота), АК, МК, глутатион восстановленный, фенозан калия (3-3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил пропионата калия, синтезирован в ИБХФ РАН) и мексидол сукцинат (2-Этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, ИБХФ РАН).

Во второй модели (термо-ХЛ) инициирование свободных радикалов происходило при термическом распаде водорастворимого азо-соединения 2.2’-азо-бис (2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП). Количество пероксидных радикалов, образующихся при термическом распаде АБАП равно: N = к[АБАП] t, где к – константа скорости генерации радикалов, t — продолжительность реакции. В водной среде при рН=7,4 и Т=370С, k=1,36∙10-6 c-1. Для антиоксиданта с концентрацией [АО] время ингибирования генерации пероксидных радикалов tinh = n[АО]/k[АБАП], где n – соответствующий стехиометрический коэффициент [9, 15]. Возникшие радикалы детектировались в реакции окисления люминола, сопровождающейся ХЛ. Преимуществом модели термо-ХЛ (ТХЛ) является постоянство скорости инициирования радикалов при стабильной температуре [10]. Регистрация ТХЛ осуществлялась на приборе minilum® [www.minilum.de] при Т=37±0,01°C с применением соответствующих наборов реактивов с общим объемом в ХЛ ячейке 1,5 мл. Для измерений использовались те же индивидуальные АО, как и для первой модели. В обеих ХЛ системах основным измеряемым параметром, характеризующим АОА изучаемых соединений, являлся период индукции t. Он определялся как время от момента инициирования окисления до точки пересечения с временной осью касательной, приложенной к ХЛ кривой в точке её перегиба, соответствующей максимуму первой производной. Для соединений, снижающих интенсивность ХЛ без выраженного периода индукции, параметром АОА являлась степень угнетения интенсивности ХЛ по сравнению с холостой пробой в точке ее максимума (I0/I). Ошибка измерений этих параметров для первого прибора с учетом повторяемости результатов составила не более 15%, для второго — 5%.

На рис. 1 приведены кинетические ХЛ кривые, полученные на обеих моделях окисления для тролокса, АК, МК, и глутатиона, а на рис. 2 – для фенозана калия (ф) и мексидола (м). Видно, что первые 4 АО не подавляют максимальную амплитуду ХЛ и имеют значительный период индукции для обеих моделей (рис.1а,б). Мексидол и фенозан демонстрируют уменьшение амплитуды (рис. 2)

 

Рисунок 1. Характерные кинетические кривые развития ХЛ (зависимость интенсивности I от времени t) для двух моделей окисления люминола с различными инициаторами: «Hb— H2O2» (а) и «АБАП» (б). Здесь: кривая 0 –

холостая проба, 1 – МК, 2 – тролокс, 3 – АК, 4 – глутатион. Концентрация всех веществ, вводимых в ХЛ-ячейку, 1мМ,  объем 1мкл.

 

 

Рисунок 2. Кинетические кривые ХЛ для двух моделей окисления люминола с инициатором «Hb— H2O2» (а) и «АБАП» (б). Здесь: кривая 0 – холостая проба, ф – фенозан, м – мексидол, рядом с буквами – вводимый в ячейку объем АО в мкл. Концентрация обоих АО 1мМ.

 

Период индукции ХЛ в присутствии АО можно рассматривать как время, необходимое для их инактивации в процессе взаимодействия с образующимися в системах радикалами-инициаторами. Тролокс, АК и МК ведут себя как сильные АО, а их ХЛ кривые похожи для обеих систем, глутатион же, являясь слабым АО, не подавляет свечение полностью и не имеет выраженного периода индукции. В случае мексидола и фенозана у двух ХЛ моделей имеются отличия: ингибирование фенозаном окисления люминола, инициированное в системе с АБАП, значительно сильнее, а для мексидола тушение ХЛ примерно одинаково для обеих систем.

На рис. 3 представлены зависимости периода индукции t от концентрации АО для обеих ХЛ моделей. В исследуемом диапазоне концентраций эта зависимость линейна t=k[AO], и k определяет антирадикальную активность АО.

 

Рисунок 3. Зависимость периода индукции (t) от концентрации АО в ХЛ-ячейке для двух ХЛ окислительных систем с «Hb-H2O2» (а) и «АБАП» (б). Прямые 1 – МК, 2 – тролокс, 3 – АК, 4 – глутатион.

 

Для мексидола и фенозана были построены концентрационные зависимости степени угнетения максимальной интенсивности ХЛ (I0/I) по сравнению с холостой пробой I0 и вычислен коэффициент уменьшения амплитуды ХЛ К=(I0/I-1)/[AO]. В таблице представлены значения k и К для всех исследованных АО, а также их стехиометрические коэффициенты ингибирования n (число радикалов, перехваченных АО) для двух ХЛ моделей. Для тролокса был принят n=2 для обеих моделей [3, 7, 15].

Таблица

Антирадикальная активность (k), коэффициент ингибирования амплитуды ХЛ (К) и стехиометрические коэффициенты (n) для двух окислительных моделей с «Hb-H2O2» и «АБАП» инициаторами.

АО

k, с∙М-1

К, М-1

n

  Hb-H2O2 АБАП Hb-H2O2 АБАП Hb-H2O2 АБАП
Тролокс 2,23∙108 1,13∙108 2,0 2,0
МК 2,65∙108 1,25∙108 2,37±0,16 2,22±0,11
АК 1,55∙108 0,87∙108 1,39±0,14 1,54±0,08
Глутатион 4,21∙107 1,82∙107 0,38±0,06 0,33±0,04
Мексидол 8,5∙104 3,4∙104
Фенозан 5,2∙104 7,7∙105

Самая высокая степень ингибирования окисления люминола (К) оказалась у фенозана в модели с АБАП, значительно (~ в 20 раз) превышая К для мексидола. Для первой модели разница К для этих двух АО не такая значительная (~1,5). Что касается стехиометрического коэффициента n, для МК, АК и глутатиона в пределах ошибки эксперимента он практически одинаков для обеих окислительных систем. Стехиометрические коэффициенты для тролокса, МК, АК, определялась многими авторами [3, 7, 15]. Наиболее близкие к нашим значениям величины n получены в работе [15] для модели с АБАП-инициатором. В этой же работе было измерено также n=0,44 для соединений SH-групп, однако кинетика ХЛ исследована не была. Как уже было отмечено ранее, кинетические ХЛ кривые для глутатиона в обоих методах (рис. 1) резко отличаются от ХЛ кривых для других АО, не имея хорошо выраженного периода индукции. Это свидетельствует о том, что глутатион взаимодействует с образующимися в процессе окисления промежуточными интермедиатами, меняя скорость и кинетику окисления. Как показано в работе [8], некоторые тиильные соединения, включая глутатион, могут восстанавливать образующиеся при окислении гидропероксиды (LOOH), и это восстановление может проходить через радикальные стадии  RSH+LOOH → RS·+RO·+H2O, образуя дополнительный источник радикалов и меняя процесс ингибирования. Для первой нашей модели этим гидропероксидом, вероятно, служит H2O2, а для второй – генерируемые азоинициатором пероксидные радикалы. Поэтому период индукции и, соответственно, n для глутатиона имеют относительно низкие значения для обеих ХЛ систем.

Для тролокса, МК и АК небольшой разброс стехиометрических коэффициентов связан, вероятно, со сходством структуры молекул и мало различающейся энергией связи атома водорода в ОН-группах.

Мексидол и фенозан калия являются, как и большинство монофенолов, слабыми ингибиторами. Как и в моделях цепного окисления углеводородов, при генерации свободных радикалов в системе с АБАП экранирование OH-группы (фенозан) приводит к существенному повышению эффективности АО по сравнению с неэкранированным фенолом. Трет-бутильные заместители в орто-положении, с одной стороны, препятствуют участию образующегося феноксильного радикала в дальнейшем инициировании свободнорадикальных реакций, а с другой стороны, повышают электронную плотность на OH-группе, снижая энергию ее диссоциации. При инициировании окисления люминола системой «Hb-H2O2» отсутствие такого эффекта, возможно, свидетельствует о том, что с радикалами, образующимися в этой системе (О2·, ОН·, феррилрадикал), неэкранированный фенол реагирует с больше скоростью, нежели экранированный.

Таким образом, для ряда сильных АО (тролокс, аскорбиновая и мочевая кислоты) значения АОА и стехиометрических коэффициентов ингибирования оказались не зависящими от способа генерации радикалов в модельных системах, основанных на ХЛ люминола, и близкими по значению к данным, полученным с помощью других методов. Синтетические АО-монофенолы (мексидол, фенозан), как и большинство подобных соединений, не подавляют свечение полностью, а только снижают его интенсивность; при этом соотношение ингибирующей активности этих соединений находится в сильной зависимости от выбранной системы генерации радикалов. Данные по кинетике хемилюминесценции и коэффициентах ингибирования исследованных АО, полученные в настоящей работе на двух ХЛ моделях с разными моделями инициирования окисления, помогут в интерпретации результатов измерения АОА различных биологических субстанций в медико-биологических исследованиях.

Список литературы:

  1. Bartosz G. Non-enzymatic antioxidant capacity: limitations of use in biomedicine.//Free Radical Research. 2010. V. 44. pp. 711-720.
  1. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Изучение суммарной активности природных антиоксидантов хемилюминесцентным методом // Биофизика. — 1988. — Т. 33, № 4. — c. 584-588.
  2. Bastos E.L., Romoff P., Eckert C.R., Baader W.J. Evaluation of Antiradical Capacity by H2O2-Hemin-Induced Luminol Chemiluminescence // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 57. pp. 7481-7488.
  3. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Кинетика окси-хемилюминесценции и ее использование для анализа антиоксидантов. //Кинетика и катализ. 2004. Т.45. №3. с. 355-362.
  1. Karadag A., Ozxelik B., Saner S. Review of Methods to Antioxidant Capacities. //Food Anal. Methods. 2009. N.2. pp. 41-60.
  1. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Владимиров Ю.А. Антиоксидантная активность сыворотки крови. // Вестник РАМН. 1999. №2. с.15-22.
  2. Lissi E.A., Salim-Hanna M., Pascual C., Castillo M. D. Evaluation of total antioxidant potencial (TRAP) and total antioxidant reactivity from luminol-enchanced chemiluminescence measurement. Free Radic. Biol. Med. 1995. V. 18. N. 2. pp. 153-158.
  3. Менгеле Е.А., Круговов Д.А., Касаикина О.Т. «Влияние меркаптоэтанола на окисление углеводородов и цистранс-изомеризацию ненасыщенных липидов» // Известия Академии наук. Серия химическая. 2015. №4. с. 1-6.
  4. Niki E.: Free Radical Initiators as Source of Water- or Lipid-Soluble Peroxyl Radicals. METHODS IN ENZYMOLOGY. Eds. L. Packer & A.N. Glazer. Academic Press. NY, 1990. V. 186. pp. 100-108.
  5. Popov I., Lewin G.: Antioxidative homeostasis, its evaluation by means of chemiluminescent methods. In: Handbook of chemiluminescent methods in oxidative stress assessment. (Eds. I. Popov and G. Lewin), Transworld Research Network, Kerala, 2008, pp. 361-391.
  6. Pinchuk I., Shoval H., Dotan Y., Lichtenberg D. Evaluation of antioxidants: Scope, limitations and relevance od assays. // Chemistry and Physics of Lipids. 2012. V. 165. pp. 638-647.
  7. Roginsky V., Lissy E. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food // Food Chemistry. 2005. V. 92. pp. 235-254.
  8. Русина И.Ф., Карпухин О.Н., Касаикина О.Т. Хемилюминесцентные методы в исследовании ингибированного окисления. // Химическая физика. 2013. Т. 32. №8. с. 1-15.
  9. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А.: Ингибирование сывороточными антиоксидантами окисления люминола в присутствии гемоглобина и пероксида водорода. // Вопросы медицинской химии. 1997. Т. 43. №2. c. 87-93.
  10. Uotila J.T., Kirkkola A.L., Rorarius M. et al. The total peroxyl radical-trapping ability of plasma and cerebrospinal fluid in normal and preeclamptic parturients // Free Radic. Biol. Med. 1994. V. 16, N. 5. pp. 581-590.[schema type=»book» name=»ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ И СТЕХИОМЕТРИИ НЕКОТОРЫХ БИОАНТИОКСИДАНТОВ ДВУМЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМИ МЕТОДАМИ» description=»Определены антиоксидантная активность (АОА) и стехиометрические коэффициенты некоторых биоантиоксидантов двумя хемилюминесцентными (ХЛ) методами с разными моделями генерации свободных радикалов: «гемоглобин — перекись водорода — люминол» и «АБАП — люминол» с целью выяснения зависимости этих параметров от способа генерации радикалов. Обнаружены различия кинетики ХЛ в этих моделях и значений АОА для глутатиона и фенозана, что объясняется строением их молекул и особенностями систем генерации радикалов.» author=»Сажина Наталья Николаевна, Попов Игорь Николаевич, Волков Владимир Анатольевич» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-03-11″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.05.2015_05(14)» ebook=»yes» ]
Список литературы:


Записи созданы 9819

Похожие записи

Начните вводить, то что вы ищите выше и нажмите кнопку Enter для поиска. Нажмите кнопку ESC для отмены.

Вернуться наверх
slot thailand slot terpercaya slot dana jendralsmaya slot maxwin slot server luar demo slot slot 4d slot terbaru slot gacor slot deposit pulsa dragonslot99 slot88 selotgacorku slot thailand slot terbaru data hk
404: Not Found