Изучены биологические свойства бактерий рода E. faecalis и Blastocystis spp. в системе ассоциативного симбиоза кишечника человека, выделенные у лиц, проживающих в г. Санкт-Петербург, до и после их совместного культивирования. Обнаруженная в процессе сокультивирования с простейшими бластоцистами динамика изменения персистентных характеристик (АЛА, АЛфА и АГА) энтерококков говорит о механизме взаимодействия в системе типа эукариот – прокариот, позволяющих бактериям – энтерококкам сохраняться и накапливаться в протозойно-бактериальных ассоциациях.
Введение. Проблема симбиоза – одна из приоритетных в современной биологической науке [1, c. 153]. По современной концепции симбиотические ассоциации представляют собой форму сосуществования неродственных организмов, и ключевой вопрос в ней – механизмы симбиотических отношений [1, c. 169]. Анализ направленности межмикробных взаимоотношений позволяет прояснить патогенез широкого спектра заболеваний, правильно оценить происхождение тех или иных аномалий в структуре микросимбионтов, приводящих к изменению их типичных или проявлению новых биологических свойств [3, c. 98] .
На фоне широкой распространенности паразитарных инфекций, большое внимание в настоящее время получила протозойная инвазия – бластоцистоз, обусловленная паразитированием в толстой кишке простейших Blastocystis spp. Возбудитель бластоцистной инвазии является микроорганизмом, к усилению агрессии которого, с одной стороны, могут приводить факторы, снижающие защитные силы макроорганизма, а с другой — микроорганизмы, входящие в состав симбиоценоза [2, c. 35].
Установлено, что бластоцисты участвуют в формировании микробиоценоза данного биотопа [3, с. 118]. При этом способность простейших к заселению той или иной экологической ниши зависит от наличия у бластоцист определенных биологических свойств (антибиотикоустойчивость, синтез токсинов, ферментов защиты и агрессии). В этом плане особый интерес представляют факторы персистенции, позволяющие микроорганизму длительное время сохранять жизнеспобность в организме человека. Влияние факторов внешней среды модифицируют не только защитные силы макроорганизма, но и изменяют свойства микроорганизмов.
В настоящее время наименее изученными остаются механизмы, обеспечивающие симбиотические связи в формировании протозойно-бактериальных ассоциаций кишечника человека.
В связи с этим целью исследования явилась комплексная оценка взаимодействия E. faecalis и Blastocystis spp. в системе ассоциативного симбиоза кишечника человека.
Материалы и методы исследования. Объектами исследования явились бактериальные ассоциации биотопа толстого отдела кишечника 851 обследованных и 150 практически здоровых лиц.
Количественную и качественную оценку микроценоза проводили в соответствии с приказом Минздрава России от 09.06.2003 № 231«Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных.
Изучение антилизоцимной (АЛА), антилактоферриновой (АЛфА), антигистоновой (АГА) активностей у клинических изолятов Enterococcus fаecalis и Blastocystis spp. проводили фотометрическим методом (Бухарин О.В. с соавт., 1999, 2002, 2004).
В работе использовали штаммы Blastocystis spp., выделенные у обследованных. Для получения культур простейших использовали среду Surech. Выявление бластоцист в препаратах проводили микроскопическими и культуральными методами.
Для выделения энтерококков использовали энтерококк агар (НПЦ,
г. Оболенск) с последующим накоплением на Columbia agar (Bio-Rad, Франция) с кровью и идентификацией на среде Diskinson Oxoid (Himedia, Индия).
Результаты.
Обобщая полученные экспериментальные данные, следует отметить, что штаммы бластоцист, выделенные из фекалий обследованных способны к инактивации отдельных факторов естественной противоинфекционной резистентности макроорганизма (АЛА, АЛфА и АГА). Данные признаки могут способствовать колонизации слизистых оболочек кишечника простейшими Blastocystis spp. и служить предпосылкой для понимания некоторых механизмов формирования микросимбиоценоза изучаемого биотопа.
У клинических изолятов Е. faecalis выявлено широкое распространение факторов персистенции (АЛА, АЛфА и АГА). В ходе сравнительного анализа персистентных признаков энтерококков был обнаружен разнонаправленный характер их проявления (рис. 1). Наиболее выраженной оказалась АЛфА. Она обнаружена у 96,66±7,3% штаммов.
Далее были изучены биологические свойства и изменение патогенного потенциала клинических изолятов энтерококков при ассоциативном симбиотическом взаимодействии с Blastocystis spp. in vivo и при их сокультивировании in vitro.
Рис. 1. Частота встречаемости АЛА, АЛфА и АГА штаммов Е. faecаlis,
выделенных у лиц инвазированных бластоцистами
Показано, что при соинкубировании с Blastocystis spp. антилизоцимная активность Е. faecalis составила в среднем 3,2±0,02 мкг/мл (р<0,01) (до сокультивирования 2,2±0,02 мкг/мл). В 72,22±6,3% (52 штамма) наблюдалось повышение свойства в среднем в 2,8 раза, снижение способности в 1,8 раза к инактивации лизоцима проявилось у 20 культур (27,78±1,7%) энтерококков от исходного уровня (р<0,05).
Анализ динамики изменения АЛА энтерококков в ходе сокультивирования с простейшими показал, что в первые 30 мин уровень персистентного свойства штаммов бактерий вырос с 2,4±0,02 до 2,6±0,03 мкг/мл. На 6-е сутки эксперимента показатель АЛА Е. faecalis достиг максимума и составил 3,5±0,02 мкг/мл. В последующие сроки АЛ признак бактерий достоверно не изменялся. В контрольных образцах в течение всего эксперимента АЛА находилась в пределах 2,1±0,02–2,4±0,02 мкг/мл (р<0,05).
Изучение изменения уровней АЛфА энтерококков в ходе экспериментального сокультивирования с бластоцистами показал, что у 80,46±4,3% штаммов показатели АЛфА увеличивались, а 19,54±1,9% не изменяли активность. Уменьшение показателей АЛфА не наблюдалось ни в одном случае. При сокультивировании энтерококков с бластоцистами в течение первых 6 суток эксперимента не было выявлено заметного увеличения изучаемого свойства у бактерий. Следует предположить, что данная тенденция объяснялась адаптацией популяции энтерококков к цитопатогенному действию штаммов бластоцист, устойчивых к АЛф признаку.
Однако начиная с 7-х суток, и в течение последующих 6 дней соинкубирования у энтерококков в 2 раза увеличились показатели АЛфА со значений 65±0,02 до 126±0,03 нг/мл.
Антигистоновая активность Е. faecalis в ходе экспериментального сокультивирования с бластоцистами повышалась до 4,3±0,05 мкг/мл (до сокультивирования показатель был равен 3,2±0,02 мкг/мл; р<0,05).
Проведенный сравнительный анализ изменения персистентных свойств простейших Blastocystis spp. при сокультивировании c бактериями Е. faecalis показал, что в отсутствие энтерококков выраженность АЛА бластоцист составляла
2,1±0,09 мкг/мл, а при сокультивировании с бактериями Е. faecаlis выросла почти в 2 раза и составила 4,8±0,08 мкг/мл (р>0,05).
Изучение динамики изменения АЛА бластоцист после сокультивирования с энтерококками показало два значительных подъема показателей АЛА, регистрируемых на 3–6 сутки и на 16–20-е сутки эксперимента. АЛА выросла
с 2,5±0,03 мкг/мл до 3,3±0,05 мкг/мл в первый подъем и с 3,9±0,03 мкг/мл
до 4,8±0,01 мкг/мл во второй подъем соответственно.
Выявлено значительное влияние штаммов Е. faecаlis на антилактоферриновую активность бластоцист при их совместном культивировании. Уровень АЛфА признака простейших составил 118 нг/мл до начала эксперимента и 163 нг/мл – в присутствии Е. faecаlis (р<0,01). В контроле АЛфА бластоцист не превышала 74 нг/мл (р<0,01).
Установлено также угнетающее действие Е. faecаlis на персистентные свойства бластоцист. Так, в отсутствие энтерококков уровень АГА бластоцист составлял 6,5 мкг/мл, а при их совместном культивировании она снижалась до 2,7±0,04 мкг/мл (р<0,01). Естественно предположить, что при взаимодействии типа эукариот-прокариот бактерии, скорее всего, эволюционно приспособились к бактерицидному действию гистонов, проявляя антигистоновую активность и понижая значения этого признака у простейших бластоцист.
Обобщая данные, полученные в результате экспериментального сокультивирования, следует отметить, что внутри протозойно-бактериальных ассоциаций можно выделить несколько основных типов связей по направленности действия:
- взаимное увеличение экспрессии признака у микроорганизмов- симбионтов;
- обоюдное снижение факторов персистенции у участников ассоциации;
- повышении экспрессии признака одного участника ассоциации, но при этом снижение свойств другого.
Установленное наличие антилизоцимной, антилактоферриновой и антигистоновой активности у бактерий-ассоциантов простейших обеспечивает им защиту от лизоцима, белков – лактоферрина и гистонов эукариот, способствует реализации межмикробных взаимодействий.
Можно предположить, что выявленное нарастания экспрессии персистентных характеристик у энтерококков при бластоцистозе, ограничивает размножение паразитов в кишечнике больных, что представляет собой процесс взаимной адаптации, направленный на обеспечение совместного длительного паразитирования в макроорганизме.
Обнаружение персистентных характеристик энтерококков в монокультуре и изменение их показателей при сокультивировании с простейшими бластоцистами пополняет изучаемый спектр механизмов, обеспечивающих симбиотические связи в протозойно-бактериальных ассоциациях.
Список литературы.
- Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз // Екатеринбург: УрО РАН, 2007. 264 с.
- Ильина Н.А. Микробиоценоз кишечника человека при бластоцистной инвазии и влияние Blastocystis hominis на макроорганизм: Автореф. дис. … д. биол. наук. Саратов, 2005. 41 с.
- Простейшие Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм (монография) / Под ред. Н.И. Потатуркиной-Нестеровой. Наука СПб., 2009. 148 с.[schema type=»book» name=»БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ АССОЦИАЦИЙ КИШЕЧНИКА, ВЫДЕЛЕННЫХ У ЖИТЕЛЕЙ Г. САНКТ-ПЕТЕРБУРГ» author=»Бугеро Нина Владимировна, Аронова Екатерина Борисовна, Ильина Наталья Анатольевна » publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-04-25″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 28.03.2015_03(12)» ebook=»yes» ]