На сегодняшний день возрос интерес к изучению свойств липопротеинов и их белковых компонентов как естественных транспортных систем крови. Такой интерес обусловлен их способностью образовывать устойчивые взаимодействия с различными биологически-активными соединениями, в том числе лекарственными препаратами. Показана способность липопротеинов осуществлять транспорт некоторых препаратов цитостатического действия [1, с. 50]. Одной из уникальных особенностей липопротеинов является возможность образования комплексов с липопфильными и водорастворимыми соединениями и наличие рецепторов к ним практически во всех органах и тканях организма. В НИИ биохимии СО РАМН было показано, что большой вклад в образование комплексов вносят белковые компоненты липопротеинов – аполипопротеины. Из целого ряда аполипопртеинов наиболее перспективным, как комплексообразователь, показал себя основной белковый компонент липопротеинов высокой плотности аполипопротеин А-I. Были получены данные о способности апоА-I образовывать комплексы с различными биологически активными соединениями: стероидными гормонами, витаминами, противоопухолевыми препаратами [2, с. 23; 3, с. 364]].
Целью данного исследования явилось исследование возможности аполипопротеина А-I образовывать комплекс с противоопухолевыми препаратами актиномицином Д и винбластином.
Выделение липопротеинов из плазмы крови человека проводили методом ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na2 [4, с. 33]. Фракцию липопротеинов высокой плотности (ЛПВП, 1,063<d<1,21 г/мл) делипидировали смесью хлороформ-метанол (1:1) с многократной отмывкой эфиром. Смесь белков разделяли методом колоночной хроматографии, элюент: 6 М мочевина, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид. Проверка чистоты аполипопротеина А-I осуществлялась с помощью электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом Na (SDS Na) [5, с. 680]. Обессоливание белка проводили методом гель-фильтрации. В качестве элюента использовали 5 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.
Рис. 1. Электрофореграмма хроматографической очистки
аполипопротеина А-I.
1 – низкомолекулярные белки-стандарты;
2 – суммарные белки ЛПВП;
3-6 – стадии очистки апоА-I.
В работе использовали 1 мМ раствор актиномицина Д и винбластин. Взаимодействие апоА-I с актиномицином Д изучали методом спектрофлуоримерии при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне от 300 до 450 нм. Титрование проводили добавлением аликвот противоопухолевого препарата (по 10 мкл) к 2 мл аполипопротеина А-I. Расчет константы связывания осуществляли по методу Аттала и Лата [6, с. 325].
Методом тушения триптофановой флуоресценции показано взаимодействие липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I с актиномицином Д и винбластином. Снижение флуоресценции составило от 73% до 88%. Данное снижение можно расценивать как результат образования комплекса липопротеинов высокой плотности с актиномицином Д и винбластином, а также аполипопротеина А-I с актиномицином Д и винбластином (Рис. 2,3).
Рисунок 2. Спектры триптофановой флуоресценции аполипопротеина А-I в комплексе с актиномицином Д
1- Аполипопротеин А-I;
2- Актиномицин Д;
3-9 – добавление аликвот актиномицина Д к аполипопротеину А-I.
Рисунок 3. Спектры триптофановой флуоресценции аполипопротеина А-I в комплексе с винбластином
1- Аполипопротеин А-I;
2- винбластин Актиномицин Д;
3-9 – добавление аликвот винбластина к аполипопротеину А-I.
Рассчитано количество молекул противоопухолевых препаратов, которое может быть связано с ЛПВП и апоА-I, оно составило 26 и 28 молекул актиномицина и винбластина на один моль ЛПВП, 12 и 45 молекул актиномицина и винбластина на 1 молекулу аполипопротеина А-I. Полученные данные позволили нам сделать предположение о возможности использования ЛПВП и аполипопротеина А-I в качестве эффективной транспортной формы актиномицина Д и винбластина. Произведен расчет констант ассоциации для комплексов апоА-I-винбластин – 3,8 х 105 М-1 и апоА-I – актиномицин Д — 1,4 х 105 М-1, которые указывают на то, что связывание белок-лиганд не является высокоспецифичным, однако это может оказаться положительным моментом при освобождении противоопухолевого препарата после доставки его в опухолевую клетку. Количество мест связывания представляет широкий диапазон регулирования дозировки препарата.
Литература:
- Malik M., Sabnis N.,2 Lacko A. Bacterial Apoa-1 Purification for the Deliverance of an Anticancer Drug Delivery System. J Biomol. Tech. 23: 50–51.
- Поляков Л.М. Липопротеины плазмы крови: транспортная система для ксенобиотиков и биологически активных веществ. 1998. Бюл. СО РАМН. 3: 23-29.
- Polyakov L.M., Sumenkova D.V., Knyazev R.A., Panin L.E. The analysis of interaction lipoproteins and steroid hormones. 2010. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 4(4): 362 – 365.
- Суменкова Д. В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. 2012. Липопротеины высокой плотности как транспортная форма даунорубицина в клетки гепатомы мышей. Экспериментальная и клиническая фармакология. 75(5): 32-34.
- Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . 1970. Nature. 227: 680-685.
- Attalah N.A., Lata G.F. Steroid-protein interactions studied by fluorescence quenching. 1968. Biochem. Biophys. Acta. 168(2): 321-333.[schema type=»book» name=»ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I С АКТИНОМИЦИНОМ Д И ВИНБЛАСТИНОМ» author=»Князев Роман Александрович, Твердохлеб Наталия Викторовна, Поляков Лев Михайлович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-06-05″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)» ebook=»yes» ]