Флуктуации активности ферментов, конформаций белковых молекул связаны с разными факторами, в том числе состоянием растворителя – воды [2], физраствора и др. В данной работе исследовали флуктуации времени свертывания плазмы крови.
Методика. Кровь забирали из вены в пробирки с цитратом натрия (на станции переливания крови) от лиц 18-35 лет. Получали центрифугированием обедненную тромбоцитами плазму. К 0,1 мл плазмы добавляли 0,2 мл хлористого кальция и измеряли время появления сгустка («время рекальцификации»).
Результаты. При разбавлении плазмы крови в 2 раза физраствором показатели времени свертывания (количество повторных замеров /n/ от 40 до 143) приобретают тенденцию к стабилизации (среднеквадратическое отклонение /d/снижается с 13,9±4,7 до 9,0±1,1%; Р<0,1). (Таблица1) В одной из серий (n=143) до разбавления показатели свертывания варьировали со среднеквадратическим отклонением 21%; в той же плазме, разбавленной в 2 и 4 раза дистиллированной водой коэффициент вариативности снизился с 21% до 5% и 3%, соответственно. (Рис. 1) Тот же образец плазмы (не разбавленный водой), сохраненный трое суток, утратил флуктуационную активность. (Рис. 1)
[В данном аспекте интересно решение параллельной проблемы. При оценке титра антител к лекарственным препаратам методом реакции связывания комплемента использовали свежую сыворотку человека. Получаемые результаты постоянно варьировали в одной и той же пробе крови больного; не удавалось определить истинный титр анти- тел. Исходя из опыта работы выход был найден быстро – пробы (после внесения сыворотки крови в буфер) начали оставлять на ночь и лишь затем продолжали методику замера. Флуктуации прекратились. [1,3] ]
Таблица 1
Изменение коэффициента вариации времени свертывания (рекальцификации; в секундах) после разбавления плазмы
| Серии опытов (количество экспери-мен- тов) | Неразбавленная плазма (контроль) | Разбавленная в 2 раза | Разбавленная в 4 раза | ||||||
| n | d% | M±m,
сек. |
n | d% | M±m,
сек. |
n | d% | M±m,
сек. |
|
| 1 | 20 | 5 | 180±2 | 20 | 3* | 170±1 | |||
| 2 | 30 | 6 | 183±2 | 37 | 3* | 171±1 | |||
| 3 | 21 | 15 | 372±12 | 21 | 9* | 424±8 | 20 | 8* | 560±10 |
| 4
(см. рис. 1) |
71 | 21 | 209±10 | 37 | 5* | 183±2 | 37 | 3* | 171±1 |
| 5 | 21 | 7 | 131±2 | 21 | 7 | 123±2 | 20 | 10 | 152±3 |
| 6 | 22 | 6 | 147±2 | 21 | 8 | 142±3 | 21 | 8 | 159±3 |
| 7 | 20 | 8 | 175±3 | 19 | 10 | 172±4 | 17 | 18* | 192±8 |
| 8 | 20 | 9 | 198±4 | 21 | 14 | 257±8 | 20 | 14 | 357±11 |
| 9 | 20 | 11 | 164±4 | 20 | 10 | 153±3 | 15 | 22* | 185±10 |
| Итого для 7 серий |
160 |
||||||||
| М ср. | 13,9±4,7 | 9,0±1,1 | 11,8±2,5 | ||||||
| Р | <0,1 | >0,5 | |||||||
| Итого для 9 серий |
— |
||||||||
| М ср. | 12,0±3,7 | 9,9±2,3 | |||||||
| Р | >0,5 | ||||||||
Примечание: * – Р<0,025 по критерию Фишера.
n – Количество замеров всемени выпадения сгустка. [Плазму 20- 150 раз забрали в отдельную пробирку по 0,1 млиз общей емкости, добавляли 0,2 млраствора хлорида кальция (для восстановления содержания ионов кальция, без которых свертывание не происходит), что запускало каскад свертывающей системы.]
Рис.1. Флуктуации времени свертывания плазмы крови в секундах.
Точками снизу вверх обозначены последовательно получаемые инварианты замеров. Нижние графики – суммарное распределение инвариант. При разбавлении плазмы в 2 и 4 раза остался ведущий (наиболее вероятностный) пик значений (в диапазоне 170-190 секунд).Рис.1. Флуктуации времени свертывания плазмы крови в секундах.
Методической ошибкой (мерой неаккуратности) проводимых исследований (по определению времени рекальцификации) можно считать минимальный разброс, соответствующий среднеквадратическому отклонению в 3%. То есть флуктуации не случайны.
Таким образом, разбавление плазмы может привести как к снижению (серии 1-4), так и увеличению (в сериях 7 и 9 таблицы) разброса флуктуаций. Торможение во времени свертывания плазмы после ее разбавления (в сериях 3 и 8), возможно, связано со снижением концентрации факторов коагуляционного гемостаза (низким содержанием белков у данных доноров). На таких пробах крови, предположительно, можно изучать гетерогенные структуры (трубчатые, сферические, плоскостные) в аспекте структуризации жидкости [данный методический подход сложен, но реален]. Сокращение времени свертывания (в сериях 1, 2, 4) после разбавления указывает, вероятнее, на постепенную активацию факторов контактными поверхностями в процессе эксперимента.
[20-летняя работа с кровью показала, что с годами найти донора с хорошим разбросом данных все труднее. Для этого нам приходилось просить сдать кровь студента местной национальности, здорового, молодого по возрасту. (Грубо выражаясь, природа постепенно умирает; разбросов все меньше. Если раньше на реках весной лед трескался и шел ледокол, то сейчас постепенно тает без синхронизации процесса.) То есть исчезает кооперативность (quorum sensing /чувство локтя/) – согласованность в работе флуктуирующих молекул. Если каждая молекула флуктуирует сама по себе, то в итоге должны получаться среднестатистические – одни и те же значения.]
Список литературы:
- Говорин Н.В., Ложкина А.Н. Антитела к нейролептическим препаратам и их место в меха- низмах терапевтической резистентности при пара- ноидной шизофрении / / Ж. невропатол. и психиат- рии им. Корсакова. – 1991. — N 7. — С. 117-121.
- Захаров С. Д., Зюзин М. В., Мосягина И. В. Вода: микроструктура и флуктуации //
- Ложкина А.Н., Говорин Н.В. Определение антител к нейролептическим препаратам реакцией поглощения компле- мента в сыворотке крови больных шизофренией // Лабораторное дело. – 1991. — № 10. – C. 78.[schema type=»book» name=»ФЛУКТУАЦИИ БЕЛКОВ СВЕРТЫВАЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ РАЗБАВЛЕНИИ ВОДОЙ И ФИЗРАСТВОРОМ» description=»Исследовали флуктуации коагуляционной активности плазмы крови. Замеряли время свертывания (рекальцификации) цитратной плазмы доноров без разведения физраствором или дистиллированной водой (i), после разведения в 2 (ii) и 4 (iii) раза. Измерения повторялись 20-100 раз. Флуктуации времени сверты- вания плазмы крови после разбавления дистиллированной водой резко снижались; после разведения физраствором данные неоднозначны. Требуются дополнительные эксперименты.» author=»Ложкина Анна Николаевна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-01-11″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.11.16_32(1)» ebook=»yes» ]