ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ПОВИЛИКИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ.

В последние годы возрос интерес исследователей к растениям-паразитам в составе которых определены различные цитотоксины [1]. Наиболее изучены цитотоксины белковой природы активно подавляющие рост раковых клеток в культуре тканей, что во многом стимулирует исследователей к поиску новых источников их выделения [2,3].

Одним из малоизученных объектов являются лектиноподобные белки паразитирующих растений. Интерес к растениям паразитам рода Cuscuta объясняется тем, что они используются для лечения различных форм опухолей [4]. С другой стороны в последние годы появилось ряд сообщений по выделению и характеристики белков, а также активного химического начала из кускуты, названный авторами кускутные кислоты – А и Д, обнаружены противоопухолевые вещества гликозидподобной природы [1, 5, 6].

Ранее нами была изучена канцеролитическая активность различных видов повилики, произрастающих в Центральной Азии. Получены экстракты из трех видов: Cuscuta europea, Cuscuta lupuliformis, Cuscuta attenuate, паразитирующих соответственно на луговых травах, на побегах ивы и на фруктовых кустарниках. Установлено, что экстракты разных видов повилики оказались цитотоксичными в культуре тканей (от 40-80% подавления роста опухолевых клеток меланомы – рак кожи) [7]

Целью данной работы является изучение цитотоксической активности лектиноподобных гликопротеидов повилики.

В качестве растительного сырья использовали семена повилики (Cuscuta europea) произрастающие на луговых травах. Лектиноподобные белки (ЛПБ) были выделены из семян повилики путем экстракции солевым раствором с последующим ступенчатым высаливанием сульфатом аммония.

Для этого сухое сырье измельчали и переносили в фосфатно солевой буфер (ФСБ), содержащий 0,14 М NaCl, рН 7.7. Экстрагировали 2 ч на магнитной мешалке. Экстракт центрифугировали и собранные после центрифугирования супернатант (суммарные белки) подвергали ступенчатому высаливанию сульфатом аммония: одну часть осаждали сульфатом аммония до конечной концентрации 20% и вторую часть – до 50%. Центрифугировали и полученные супернатанты, обозначенные нами С₂₀ и С₅₀и осадки – ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀, диализовали против дистиллированной воды. Содержание белка определяли по методу Лоури [8]. Содержание углеводов определяли антрон-сернокислотным методом. [9]. Гемагглютинирующую активность ЛПБ определяли с использованием 2% суспензии крови человека или кролика в 96U – образных иммунологических планшетах [10].

Установлено, что наибольшую гемагглютинирующую активность проявляли фракции ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀. Углеводную специфичность определяли, как описано в работе Поспелова [10]. Показано, что специфичность к глюкозе и маннозе проявила фракция ЛПБ₅₀.

Ранее нами показано цитотоксическое действие белков ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀ на клетках Hela и В-16 [11].

В данной работе изучена цитотоксическая активность на клетках U₉₃₇и Акат.

Клеточная культура Акат выведена нами из перевиваемой опухоли Акатон (рак тонкой кишки мыши) для изучения биологически активных веществ, в том числе и противоопухолевых. Нами изучена чувствительность данной клеточной линии к действию некоторых клинических противоопухолевых препаратов разных классов: алкилирующие вещества (циклофосфан); антиметаболиты (метотрексат); противоопухолевые антибиотики (доксорубицин); вещества растительного происхождения (винбластин); синтетические противоопухолевые препараты – цисплатин.

Цитотоксический эффект препаратов оценивали МТТ — тестом. Для определения цитотоксического действия перевиваемую культуру клеток Акат рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 20-30 тыс. клеток/мл в 100 мкл среды RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбриона теленка и культивировали при температуре 37⁰С в СО₂ – инкубаторе. Через сутки вводили вещества в концентрациях 100, 10 и 1 мкг/мл на 100мкл среды, культивировали клетки в течение 24 часов и далее вводили в клетки МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид] для выявления живых клеток [12]. После часовой инкубации среду осторожно сливали, добавляли ДМСО и инкубировали 20 мин., затем измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 620нм.

Результаты исследования действия клинических противоопухолевых препаратов на клеточную линию Акат представлены в таблице 1.

Таблица 1

Действие клинических противоопухолевых препаратов на клетки АКАТ

Дозы Препараты	Процент подавления роста клеток, дозы мкг/мл.
Дозы Препараты	100	10	1
Метотрексат	58	45	11
Винбластин	81	65	57
Доксорубицин	72	58	38
Циклофосфан	57	43	37
Цисплатин	96	82	63

Как следует из данных таблицы 1 стабильная клеточная линия АКАТ достаточно чувствительна к действию клинических препаратов различного механизма действия и может служит тест-системой для прескрининга широкого круга биологически активных веществ.

Цитотоксичность лектиноподобных белкв оценивали биохимически с помощью MTT-метода, подсчета живых клеток и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы [11,13]

Контролем служили клетки без воздействия веществ. Уровень активности ЛДГ в контрольных клетках брали 100%. Цисплатин взят нами в качестве положительного контроля, указывающего на чувствительность клеток к воздействию препаратов.

Данные, полученные на клетках U₉₃₇ представлены в таблице 2

Таблица 2

Действие гликопротеидов Cuscuta europea на культуру клеток U₉₃₇

Доза, мкг/мкл Образцы	Подавление включения МТТ в клетки, %			Подавление роста клеток, %			Активность ЛДГ, %
Доза, мкг/мкл Образцы	100	10	1	100	10	1	100	10	1
∑ фракция	100,0	31,0	17,0	98,0	35,0	17,0	24,0	6,0	4,0
С₂₀	48,0	49,0	51,0	50,0	43,0	51,0	19,0	5,0	3,8
С₅₀	49,0	51,0	42,0	52,0	49,0	40,0	14,5	6,5	3,0
ЛПБ₂₀	86,0	64	61	80,0	60,0	59,0	24,5	7,8	4,6
ЛПБ₅₀	93	76	53	95,0	70,0	46,0	23,0	7,5	4,2,
Цисплатин	100,0	96,0	45,0	97	88	34	25,0	23,4	3,9

Как видно из таблицы 2 наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция и фракции ЛПБ₂₀и ЛПБ₅₀— 100%, 86% и 93% при дозе белка 100 мкг/мл. Аналогичные результаты получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Нами также изучена цитотоксическая активность на культуре клеток Акат (Таблица 3).

Таблица 3

Действие гликопротеидов Cuscuta europea на культуру клеток Акат.

Доза, мкг/мкл Образцы,	Подавление включения МТТ в клетки, %			Подавление роста клеток, %			Активность ЛДГ, %
Доза, мкг/мкл Образцы,	100	10	1	100	10	1	100	10	1
∑ фракция	86,0	33,0	10,0	80,0	34,0	11,0	30,0	8,0	3,0
С₂₀	35,0	15,0	8,0	33,0	17,0	5,0	26,0	5,0	4,0
С₅₀	40,0	12,0	10,0	46,0	12,0	8,0	23,0	5,0	3,0
ЛПБ₂₀	89,0	58,0	43,0	90,0	55,0	41,0	28,0	9,0	5,0
ЛПБ₅₀	96,0	60,0	40,0	95,0	58,0	37,0	27,0	7,0	5,0
Цисплатин	98,0	85,0	35,0	97	59	34	26,0	22,0	5,0

Как видно из таблицы 3 фракции белков Cuscuta europea оказывает различное воздействие. Так, цитотоксическое действие на клетки оказывает суммарная фракция белка и фракции, полученные осаждением сульфатом аммония 20% и 50% — 100%, 89% и 96% при дозе белка 100 мкг/мл, соответственно. А также 60% цитотоксичность проявили фракция ЛПБ₅₀при дозе белка 10 мкг/мл. Аналогичные результаты подавления роста клеток получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Таким образом, нами выделены и охарактеризованы лектиноподобные белки из повилики (Cuscuta europea). Изучено цитотоксическая активность и установлено, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция лектиноподобных белков и фракции ЛПБ₂₀и ЛПБ₅₀по трем тестам, а именно по включению МТТ в клетки, по подсчету живых клеток и по уровню активности ЛДГ.

Список литературы

Du X-Mkohinata K., Kawasaki T., Guo Y-T., Miyahara K., Phytochemistry, 1998, v. 48, p. 843-850
. Lord J.M. The use of cytotoxic plant lectins in cancer therapy. // Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1 -3.
Dwek B.A., Glycobiology: toward understanding the function of sugars // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 683-720
Федюшин М.П. Некоторые материалы к истории русской онкологии // Вопр. онкол., 1953, XXVI, 6, P. 278-287).
Аnis E. et. al.Sterols and Sterol Glycosides from Cuscuta reflexa // Natural Product Sciences, 1999, N. 5 P. 124-126
Zhelev ZH. D et. , Isolation , partial characterization and complement inhibiting activity of a new glycoprotein from cuscuta euroea // BBRC, 1994, V. 202, P. 186-194
Мавлонов Г.Т., Убайдуллаева Х.А. и др., Исследование антираковых компонентов повилики Cuscuta I. // Труды международной конф., 2004, Алматы, стр.201-203.
Lowry O., Rosenbroung R., Parr A., Randall R.I. Protein measuremen with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-269
Хашимова З.С., Мангутова Ю.С., Леонтьев В.Б. Структурно — функциональное изучение гликопротеидов хлопчатника // Химия природ. соедин. 1999. №. 3. С.376-384.
Поспелов С.В. Лектины представителей рода эхинацея (Echinacea mjench.). Методические аспекты оценки активности. // Химия растительного сырья 2012, № 3 С. 143-148
Кахарова К.А.,Хашимова З.С., Сагдиев Н.Ж. Гликопротеиды паразитирующих растений (Cuscuta Europea) // Труды межд. симпозиума Фундаментальные и прикладные проблемы науки,2014, т. 3, С. 122-128
Berridge MV, Herst PM , and Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005).
Бочкарев А.В., Зимин Ю.В., Хомутов А.Е. Изменение активности лактатдегидрогеназы печени крыс при действии гепарина в условиях in vitro // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2006, № 5, с. 86-88[schema type=»book» name=»ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ПОВИЛИКИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ.» description=»Целью данной работы является изучение цитотоксической активности лектиноподобных гликопротеидов повилики. Лектиноподобные белки (ЛПБ) были выделены из семян повилики путем экстракции солевым раствором с последующим ступенчатым высаливанием 20% и 50% сульфатом аммония и обозначены ЛПБ20 и ЛПБ50. Установлено, что наибольшую гемагглютинирующую активность проявляли фракции ЛПБ20 и ЛПБ50. В полученных нами фракциях изучена углеводная специфичность и показано, что специфичность к глюкозе и маннозе проявляет фракция ЛПБ50. Цитотоксичность ЛПБ оценивали биохимически на перевиваемых клеточных культурах U937 и Акат (выведеная нами новая стабильная клеточная линия из перевиваемой опухоли Акатон -рак тонкой кишки мыши),с помощью MTT-метода, подсчета живых клеток и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы. На клеточной культуре U937 наибольшую цитотоксическую активность проявили суммарная фракция и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 — 100%, 86% и 93% при дозе белка 100 мкг/мл. На клетках Акат фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 также проявили высокую цитотоксическую активность. Аналогичные результаты подавления роста клеток получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ. Таким образом, нами выделены и охарактеризованы лектиноподобные белки из повилики (Cuscuta europea). Изучено цитотоксическая активность лектиноподобных гликопротеидов повилики. Установлено, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция лектиноподобных белков и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 по трем тестам, а именно по включению МТТ в клетки, по подсчету живых клеток и по уровню активности ЛДГ.» author=»Кахарова Камола А Азаматовна, Хашимова Зайнат Саттаровна, Сагдиев Наиль Жадитович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2016-12-23″ edition=»euroasian-science.ru_25-26.03.2016_3(24)» ebook=»yes» ]

euroasia

Похожие записи