Сохранение генетического разнообразия древесных растений возможно только при условии изучения популяционно-хорологической структуры вида и идентификации каждой элементарной популяции [1]. Основным критерием выделения популяций является специфика их генофондов [2], изучить которую можно с помощью методов молекулярно-генетического анализа.
Объектами исследований являлись четыре популяции Pinus sylvestris L. (Pinaceae), расположенные на востоке Русской Равнины: Ps_1 – в Ежихинском лесничестве Кировской области; Ps_2 – в Уренском лесничестве Нижегородской области; Ps_3 – в Коротнинском лесничестве Республики Марий Эл; Ps_4 – в Кокшайском лесничестве Республики Марий Эл.
Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса (S. Rogers) [3], модифицированный использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). Для проведения молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из свежих почек индивидуально у 46 деревьев каждой популяции. Навеска составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 184 проб ДНК с пятью праймерами посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для изучения генетической изменчивости популяций P. sylvestris амплифицировано 920 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США) и выравнивали до 10 нг/мкл.
Для молекулярно-генетического анализа был избран ISSR-метод (Inter Simple Sequence Repeats, [4]). Он основан на использовании полимеразной цепной реакции с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеотида [4; 5] с достаточно высокой точностью отжига. ISSR-праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3′-конце праймера [5; 6].
Для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера , 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мM dNTP, 5мкл тотальной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; tо отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72ºС. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 до 64°С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).
В изученных популяциях P. sylvestris выявлено 109 ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными. Доля полиморфных локусов (P95) в выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,826 до 0,950 и в среднем составила 0,879. Праймер (AGC)6C выявил самые низкие значения полиморфизма ISSR-PCR маркеров в популяциях, а праймер (АС)8T – самые высокие (Таблица 1).
Доля полиморфных локусов (Р95) в изученных популяциях варьировала от 0,474 до 0,679. Ожидаемая гетерозиготность (HE) в общей выборке составила 0,156. В популяции Ps_2 этот показатель минимальный (HE =0,101), а в популяции Ps_3 он максимальный – 0,217 (Таблица 2).
Таблица 1
Характеристика ISSR—PCR маркеров четырех популяций P. sylvestris
| ISSR-прай
меры |
Нуклео
тидная последо ватель- ность (5’→ 3′) |
Длина
ISSR-PCR марке ров, пн |
Число ISSR- PCR маркеров в популяциях | |||||
| Ps_1 | Ps_2 | Ps_3 | Ps_4 | На общую выборку | ||||
| поли
морф ных |
поли
морф ных |
поли
морф ных |
поли
морф ных |
все го |
поли
морф ных |
|||
| IS1 | (АС)8T | 220-1115 | 6
(0,400) |
6
(0,400) |
11
(0,647) |
12
(0,706) |
20 | 19
(0,950) |
| CR212 | (CT)8TG | 250-1400 | 6
(0,462) |
7
(0,412) |
14
(0,824) |
11
(0,733) |
22 | 19
(0,864) |
| CR215 | (CA)6GT | 150-1280 | 7
(0,500) |
8
(0,471) |
12
(0,800) |
11
(0,688) |
20 | 18
(0,900) |
| M27 | (GA)8C | 150-1020 | 7
(0,438) |
6
(0,462) |
8
(0,500) |
5
(0,385) |
22 | 20
(0,909) |
| X10 | (AGC)6C | 200-1400 | 10
(0,556) |
6
(0,400) |
10
(0,625) |
13
(0,813) |
23 | 19
(0,826) |
| Всего (частота) | 36
(0,474) |
39
(0,506) |
55
(0,679) |
52
(0,675) |
107 | 94
(0,879) |
||
Примечание: в скобках указана доля полиморфных локусов
Абсолютное число аллелей на локус (na) на общую выборку составило 1,953. Этот параметр наивысший в популяции Ps_3, в популяции Ps_1 он наименьший.
Таблица 2
Генетическая изменчивость четырех популяций P. sylvestris
| Попу
ляция |
||||
| Ps_1 | 0,102
(0,016) |
1,355
(0,481) |
1,167
(0,296) |
3 |
| Ps_2 | 0,101
(0,015) |
1,365
(0,484) |
1,157
(0,263) |
2 |
| Ps_3 | 0,217
(0,019) |
1,589
(0,494) |
1,370
(0,370) |
2 |
| Ps_4 | 0,206
(0,020) |
1,533
(0,501) |
1,362
(0,396) |
0 |
| На общую выборку | 0,156
(0,002) |
1,953
(0,212) |
1,598
(0,360) |
7 |
Примечание: – ожидаемая гетерозиготность; – абсолютное число аллелей на локус; -эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; – число редких ISSR-PCR маркеров, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов
Эффективное число аллелей на локус (ne) на общую выборку равно 1,598. Наибольшее значение этого параметра отмечено в популяции Ps_3, а наименьшее значение – в популяции Ps_2. Для характеристики генетической структуры популяций полезны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5% аллели. В Ps_1 выявлено наибольшее число уникальных ISSR-PCR маркеров – 3, характерных лишь для деревьев этой популяции. В Ps_2 и Ps_3 выявлено по 2 уникальных ISSR-PCR маркера. В Ps_4 не отмечены уникальные аллели (Таблица 2).
Анализ генетической структуры изученных четырех популяций показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) в среднем составила 0,338, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции (HS) равна 0,156; поэтому коэффициент генетической подразделенности популяций (GST) составил 0,537 (Таблица 3).
Таблица 3.
Генетическая структура и дифференциация четырех популяций P. sylvestris
|
ISSR- праймер |
Нуклеотидная
последовательность (5’→ 3′) |
|||
| ISSR-1 | (АС)8T | 0,323 (0,026) | 0,160 (0,011) | 0,505 |
| CR-212 | (CT)8TG | 0,323 (0,028) | 0,159 (0,018) | 0,509 |
| CR-215 | (CA)6GT | 0,367 (0,026) | 0,188 (0,024) | 0,488 |
| M27 | (GA)8C | 0,371 (0,032) | 0,113 (0,019) | 0,695 |
| X10 | (AGC)6C | 0,306 (0,028) | 0,165 (0,009) | 0,462 |
| Среднее | 0,338 (0,028) | 0,156 (0,016) | 0,537 | |
Примечание: HT – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; HS – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; GST – доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения
На Урале так же были выявлены высокие показатели межпопуляционной изменчивости у Larix sibirica Ledeb. [7] и у Populus tremula L.[8]. Таким образом, изученные четыре популяции P. sylvestris дифференцированы сильно, так как на долю межпопуляционного генетического разнообразия приходится 53,7%.
Работа выполнена при частичном финансировании в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (проект144, № гос. рег. 01201461915) и гранта РФФИ (проект № 12- 04-00062-а).
Список литературы:
- Видякин А. И., Кантор Г.Я. Пространственная организация и факторы формирования групп популяций сосны обыкновенной в Южном Зауралье // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2013. – № 10. – С. 34-39.
- Тимофеев-Ресовский Н.В. Очерк учения о популяции / Н.В. Тимофеев-Ресовский, А.В. Яблоков, Н.В. Глотов – М.: Наука, 1973. – 278 с.
- Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. – – V. l, № 19. – P. 69-76.
- Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. – – V. 20. – Р. 176-183.
- Boronnikova S.V., Kalendar R.N. Using IRAP markers for analisis of genetic variability in populations of resource and rare species of plants // Russian Jornal of Genetics. – – №1 (46). – P. 36- 42.
- Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. – – № 18. – Р. 6531-6535.
- Нечаева Ю.С. С.В. Боронникова, А.И. Видякин и др. Молекулярно-генетический анализ популяций хвойных видов растений на Урале и востоке европейской части России для сохранения и возобновления лесных ресурсов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – – Т. 16. №1(3). – С. 878-882.
- Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Нечаева Ю.С., Боронникова С.В. Генетическая дифференциация популяций Populus tremyla L. в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. – – №3 (95). – С. 11-13.[schema type=»book» name=»ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SYLVISTRIS L. НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ» description=»В четырех изученных популяциях Pinus sylvestrys L. выявлено 107 ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными (P95 = 0,879). Ожидаемая гетерозиготность (HE) на общую выборку составила 0,156. Показатели генетического разнообразия выше в популяции, расположенной в Коротнинском лесничестве республики Марий Эл (P95 = 0,679; HE = 0,217; ne = 1,370), а самые низкие их значения отмечены в популяции в Уренском лесничестве Нижегородской области (P95 = 0,506; HE = 0,101; ne = 1,157). Анализ генетической структуры четырех популяций P. sylvestrys показал, что на межпопуляционную компоненту приходиться 53,7% генетического разнообразия. » author=»Пришнивская Яна Викторовна, Нечаева Юлия Сергеевна, Красильников Виталий Павлович, Мартыненко Никита Александрович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-02-08″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_29.08.15_08(17)» ebook=»yes» ]