Злокачественные (неходжкинские) лимфомы или лимфосаркомы являются опухолями преимущественно лимфоидной ткани. Лимфоидная ткань играет важную роль в поддержании гомеостаза организма, в регуляции процессов регенерации, деления и дифференцировки клеток. Для лимфопролиферативных заболеваний, к которым относятся лимфосаркомы, характерен хронический окислительный стресс, при котором повышается количество активных форм кислорода, усилены процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран, нарушены многие биохимические процессы [1, 2].
Внутриклеточная антиокислительная защита осуществляется посредством “антиокислительного ответственного элемента» (antioxidant responsive element, ARE), обнаруженного в промоторах многих генов, индукция которых наблюдалась при окислительном стрессе [3, 4]. Активация генов посредством ARE является основанием для повышения антиоксидантной и детоксикационной функций клеток для защиты от образующихся эндотоксинов и поступающих из окружающей среды экзотоксинов, которые могут повысить риск возникновения лимфопролиферативных заболеваний [6, 11].
Цель данной работы состояла в исследовании активностей глутатионредуктазы и сопряжённого с ней фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в плазме и лимфоцитах периферической крови больных лимфомой (неходжкинской лимфомой) и поиске корреляционных взаимоотношений между ферментами лимфоцитов.
Материал и методы исследования
Объектом исследования были 30 больных лимфосаркомой (неходжкинской лимфомой, НХЛ), в возрасте 42-56 лет, проходивших курс лечения в Отделении Гематологии Онкологического Института Молдовы. Все исследования были проведены до начала курсовой химиотерапии. Контрольной группой были 20 здоровых людей, соответствующего возраста. Все процедуры были проведены согласно этическим нормам клинических исследований.
Материалом исследования была периферическая кровь больных НХЛ (лимфобластный вариант) и здоровых людей. Лимфоциты получали из периферической крови в двухступенчатом градиенте плотности фиколл-уротраст с использованием силиконированной посуды по методу Бейум [8]. Микроскопический контроль чистоты фракции лимфоцитов проводили по методу Нохта. Лизаты лимфоцитов получали инкубацией в течение 30 мин с 0,1% Тритон Х-100 (конечная концентрация) и центрифугировали в течение 10 мин при 600 g. Активность ферментов определяли спектрофотометрически, используя Humalyzer 2000 (DE). Активность глутатионредуктазы (ГР, К.Ф. 1.6.4.2) определяли по методу Horn H. [5], активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, К.Ф. 1.1.1.44) – по методу Сейц и Лугановой [10] в плазме и лимфоцитах периферической крови. Содержание белка определяли по методу Watanabe [7]. Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента с использованием пакета прикладных программ “Microstat” (Microsoft: 2007, США). Коэффициенты ранговой корреляции рассчитывали по методу Спирмена.
Результаты и обсуждение
Больные с лимфобластным вариантом НХЛ были распределены на 4 группы в зависимости от активности (стадии) патологического процесса. Результаты исследования активностей ГР и Г6ФДГ показали, что у больных наблюдались значительные изменения активностей обоих ферментов. Уровень активностей ферментов в плазме крови отражает состояние метаболизма не только клеток, циркулирующих в кровеносном русле, но также поступивших в кровь из других органов и тканей. В плазме крови в зависимости от активности патологического процесса наблюдалась тенденция возрастания активностей ферментов (табл. 1).
Таблица 1.
Активность ГР и Г6ФДГ в плазме крови больных НХЛ с разной активностью патологического процесса
| Стадия | n | ГР | Г6ФДГ |
| Здоровые | 20 | 0,019±0,001 | 0,024±0,005 |
| I | 7 | 0,011±0,002* | 0,008±0,001* |
| II | 7 | 0,015±0,002 | 0,021±0,003 |
| III | 7 | 0,018±0,003 | 0,034±0,006 |
| IV | 9 | 0,032±0,005* | 0,063±0,011* |
Примечание. Активности ГР и Г6ФДГ даны в кат/г белка.
Символ *- достоверность различий с нормой (рt<0,05).
На ранних стадиях заболевания активности ГР и Г6ФДГ были ниже, чем их активности в плазме крови здоровых людей. На поздних (III, IV) стадиях болезни уровень активностей ферментов значительно возрастал. На IV стадии болезни активность ГР составляла 168,4% (р<0,05) от активности здоровых людей (100%), повышаясь в 2,9 раз по сравнению с больными I стадии болезни.
Аналогичная картина наблюдалась с Г6ФДГ: на ранних стадиях болезни активность фермента в плазме крови была ниже, чем у здоровых лиц, повышаясь на поздних стадиях заболевания (III-IV). У больных IV стадии болезни активность Г6ФДГ составляла 262,5% (p<0,05) по сравнению с активностью здоровых, повышаясь в 7,9 раз по сравнению с уровнем фермента у больных I стадии.
Определение активностей ГР и Г6ФДГ в лимфоцитах. Активность ГР в лимфоцитах больных НХЛ была ниже активности фермента в лимфоцитах здоровых людей на всех стадиях болезни. На рис. 1 представлены активности ГР относительно активности здоровых людей (100%).
Рисунок 1. Активности ГР и Г6ФДГ в лимфоцитах больных НХЛ
ГР является единственным ферментом, восстанавливающим окисленный глутатион (GSSG) в его восстановленную форму (GSH), которая в клетке преобладает (90-95%). Снижение активности ГР в лимфоцитах больных может способствовать повышению содержания окисленного глутатиона. Известно, что высокий уровень окисленного глутатиона при пероксидном стрессе активирует пентозный цикл. С этой точки зрения снижение активности ГР может быть необходимо для регуляторных процессов. Кофермент НАДФН, необходимый ГР, генерируется в гексозомонофосфатном пути метаболизма глюкозы, ключевым ферментом которого является Г6ФДГ.
Результаты исследования активности Г6ФДГ в лимфоцитах больных НХЛ показали её незначительное снижение, составляющее 0,090 кат/г белка (77%) на первой стадии болезни в сравнении с активностью контрольной группы (0,116 кат/г; 100%) (рис. 1). У пациентов со второй стадией болезни наблюдалось незначительное повышение активности до 0,134 кат/г (115%), активность Г6ФДГ в лимфоцитах больных с III и IV стадией возрастала в 1,6 (0,185 кат/г) и 2,7 (0,313 кат/г) раз, соответственно. Повышение активности фермента, коррелирующее с уровнем активности патологического процесса у больных НХЛ, можно объяснить возрастающими метаболическими потребностями лимфоцитов и лимфобластов.
Поиск корреляции. Принимая во внимание тесную функциональную связь ГР с Г6ФДГ, был проведён поиск их корреляционных взаимоотношений, результаты которого представлены в таблице 2. В лимфоцитах больных НХЛ сохранялась тесная функциональная связь между ГР и Г6ФДГ с высоким уровнем надёжности (р<0,005).
Таблица 2.
Корреляционные взаимоотношения ГР и Г6ФДГ в лимфоцитах больных
| Ферменты | З д о р о в ы е | Больные НХЛ | ||||
| N | r | pt | n | r | pt | |
| ГР — Г6ФДГ | 10 | +0,835 | <0,005 | 16 | +0,716 | <0,005 |
Примечание. Обозначения: r- коэффициент корреляции Спирмена; рt – уровень надёжности.
Таким образом, в плазме и лимфоцитах у больных НХЛ наблюдались значительные изменения активностей антиоксидантных ферментов ГР и Г6ФДГ. Однако, функциональная связь между ферментами ГР и Г6ФДГ у больных НХЛ в лимфоцитах сохранялась с высоким уровнем надёжности (pt<0,005).
Литература
- Acworth I.N., McCabe D.R., Maher T.J. The analysis of free radicals, their reaction products, and antioxidants./ Oxidants, Antioxidants and Free Radicals (S.I.Baskin, H.Salem, eds.), Taylor and Fransis, Washington and London. 1997.- 23-77.
- Aruoma O.I. Free radicals, oxidative stress, and antioxidants in human health and disease.// J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. Vol. 75. P. 199-212.
- Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M.R. Cell signaling and the glutathione redox system.// Biochem. Pharmacol. 2002. Vol. 64. P. 1057-1064.
- Hayes J.D., Ellis E.M., Neal C.E. Cellular response to cancer chemopreventive agents: contribution of the antioxidant responsive elements to the adaptive response to oxidative and chemical stress. /Downes C.P. et al., eds. Cellular responses to stress biochemical society symposium, 64. London: Portland Press. 1999. — 141-168.
- Horn H.D. Glutathione reductase./ Bergmeyer H.-U., Methods of enzymatic analysis.- N.Y.: Academic Press. 1963. — P. 875-879.
- Paolicchi A., Dominici S., Pieri L. Glutathione catabolism as a signaling mechanism.// Biochem. Pharmacol. 2002. Vol. 64. P. 1027-1035.
- Watanabe N., Kamei S., Ohkuto A. Urinary protein as measured with pyrogallol red-molibdate analyzer.// Clin. Chem. 1986. Vol. 32. P.1551-1554.
- Бейум А.М. Лимфоциты: выделение, фракционирование, характеристика. (пер. с англ.). — М:Мир. 1980.- С. 9-19.
- Гаврилюк Л.А., Корчмару И.Ф., Робу М.В. Глутатионзависимые ферменты и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа в крови больных лимфосаркомой (неходжкинской лимфомой).// Биомед. химия. -2011. Том 57, Вып. 2.- С. 225-231.
- Сейц И.Ф., Луганова И.С. Метод определения активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в лейкоцитах.// Биохимия клеток крови.- М:1967.- С. 113-114.
- Тиунов Л.А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты. // Вестник РАМН. -1995.- №3.- С. 9-13.[schema type=»book» name=»СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗА-ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА В КРОВИ БОЛЬНЫХ С ЛИМФОМОЙ» description=»Цель работы состояла в исследовании спектрофотометрически активностей глутатионредуктазы (ГР) и сопряжённого с ней фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФДГ) в плазме и лимфоцитах периферической крови больных неходжкинской лимфомой (НХЛ) и поиске корреляционных взаимоотношений между ГР и Г6ФДГ лимфоцитов до начала терапии с помощью метода Спирмена. Объектом исследования были 30 больных НХЛ, в возрасте 42-56 лет, и 20 здоровых (контроль). Результаты исследования показали значительные изменения активностей ГР и Г6ФДГ. Однако, функциональная связь между ГР и Г6ФДГ у больных НХЛ в лимфоцитах сохранялась с высоким уровнем надёжности (pt<0,005). » author=»Гаврилюк Людмила Александровна, Яровой Динис» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2016-12-28″ edition=»euroasia-science.ru_26-27.02.2016_2(23)» ebook=»yes» ]