Известно, что генетический полиморфизм играет определенную роль в формировании нечувствительности к аспирину. Он включает в себя полиморфные варианты поверхностных тромбоцитарных белков и ферментов, которые способствуют метаболизации и биоактивации антиагрегантных веществ [7]. Примерно около 30% нечувствительности к АСК обусловлено генетическим фактором. Рядом исследователей [13]обнаружена связь мутантного аллеля G42, генетического варианта 842G[12], полиморфизма G765с, расположенного в промоторной области ЦОГ-2[8] и ответом тромбоцитов на аспирин. В настоящее время имеющиеся данные показывают, что полиморфизм GP Ia/IIa рецептора коллагена C807T, вероятно, не отвечают за возникновение нечувствительности к АСК [8,14]. В недавнем исследовании полиморфизма аллеля С 13254 Т показана его связь с резистентностью к аспирину[12].
Известно, что ген ITGA2 кодирует интегрин альфа-2, известный также как GPIa – мембранный гликопротеин, экспрессирующийся на мембранах различных клеток, включая мегакариоциты, фибробласты и тромбоциты, и образующий комплексы с тканевыми белками[18]. Комплекс GPIa и GPIIa (ITGB1) служит одним из главных рецепторов коллагена, расположенным на клеточной мембране тромбоцитов и являющегося активатором агрегации тромбоцитов.
Известно, что аллель T полиморфного маркера C807T гена ITGA2 ассоциирован с повышенной экспрессией GP Ia рецепторов тромбоцитов и повышенной адгезией тромбоцитов к коллагену. Повышенная экспрессия рецепторов GPIa/IIa на поверхности клетки обнаружена на поверхности тромбоцитов у гомозигот по аллелю Т (генотип Т/Т), в то время как у гомозигот по аллелю С (генотип С/С) наблюдается снижение экспрессии. Наличие Т-аллеля ассоциируется с увеличением скорости адгезии тромбоцитов, а следовательно, с повышением риска развития инфаркта миокарда, ишемического инсульта, тромбоэмболии [6] и может быть использовано для оценки риска развития тромбозов после ангиопластики и стентирования коронарных артерий.
Несмотря на известный факт индивидуальной вариабельности функции тромбоцитов определяемый главным образом наследственными факторами, женщины отличаются более высокой исходной реактивностью тромбоцитов и менее чувствительны к аспирину, по сравнению с мужчинами. Исследование HAPI по изучению реактивности тромбоцитов у женщин и мужчин после терапии аспирином подтверждает “роль наследственных факторов в формировании изменчивости функции тромбоцитов до- и после терапии аспирином [19]. Авторы считают невозможным предусмотреть развитие резистентности, а у женщин с сердечно-сосудистыми заболеваниями резистентность к аспирину способствует более высокому риску развития острых коронарных синдромом.
Единого определения «аспиринорезистентности» сегодня не существует. Предлагаются возможные синонимы термина «резистентность»: «вариабельность ответа на терапию аспирином» и «неудача лечения», «остаточная гиперагрегация тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии» и т.п.
Распространенность этого явления достаточно высока и, по данным ряда авторов, составляет от 5 до 48% [9, 10].
Термин «аспиринорезистентность» стал использоваться на основании того, что у ряда пациентов, имеющих данный феномен, развиваются кардиоваскулярные события, предположительно связанные с активацией тромбоцитов. Однако прямая корреляция между развитием этих событий и активацией тромбоцитов ex vivo никогда не была доказана.
Резистентность к аспирину в значительной степени ассоциирована с повышенным риском смерти, инфаркта миокарда или инсультов по сравнению с пациентами, чувствительными к аспирину. Так, среди резистентных к аспирину пациентов риск повторной артериальной реокклюзии после ангиопластики периферических сосудов, был на 87% выше [17].
Механизмы резистентности к аспирину недостаточно изучены, а пути ее преодоления до сих пор остаются нерешенной проблемой антиагрегантной терапии. Согласно Меморандуму рабочей группы по изучению резистентности к аспирину международного общества по тромбозу и гемостазу [16], среди возможных механизмов неэффективности терапии аспирином рассматривается генетический полиморфизм рецепторов GP IIb/IIIa, коллагена, ферментов ЦОГ-1, ЦОГ-2, тромбоксансинтетазы. Указанные противоречия и неоднозначная интерпретация генетических маркеров развития тромбоза, не изученность связи последних с функциональным состоянием тромбоцитов побудили нас с изучению данной проблемы.
Цель: изучить связь агрегационной активности тромбоцитов с полимофизмом гена ITGA2 у пациентов с ХСН.
Материалы и методы исследования: Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из цельной крови пациентов с использованием набора «ДНК-Экспресс» («Литех»,Россия). Полиморфизм гена определяли с использованием реагентов фирмы «Литех» методом ПЦР в реальном времени. Амплификацию и плавление ее продуктов проводили на амплификаторе с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «CFX96 Real-Time PCR Detection System» («Bio-Rad», США).
Агрегацию тромбоцитов определяли при помощи 2-канального лазерного анализатора 230LA («BIOLA Ltd», Россия) методом световой агрегометрии. Исследовались спонтанная и индуцированная агрегация тромбоцитов. В качестве индуктора агрегации использовался аденозиндифосфат (АДФ) в концентрациях 0,1 мкмоль, 1,0 мкмоль и 5,0 мкмоль. Степень спонтанной агрегации и агрегации, индуцированной 0,1 и 1,0 мкмоль АДФ определяли как максимальное значение среднего размера агрегатов и измеряли в относительных единицах. Для агрегации, индуцированной АДФ в концентрации 5,0 мкмоль, степень агрегации определяли как максимальное приращение светопропускания после добавления индуктора и измеряли в %. Нормальными принимались значения: для спонтанной агрегации – 1,0-1,5 отн. ед., для индуцированной 0,1 мкмоль АДФ – 1,0-2,0 отн. ед., для индуцированной 1,0 мкмоль АДФ – 1,5-5,5 отн. ед., для индуцированной 5,0 мкмоль АДФ– 25-70%.
Результаты
В исследование были включены 88 больных с ХСН, причиной которой являлись ишемическая болезнь сердца (ИБС) с сопутствующей артериальной гипертонией (АГ) (средний возраст составил 69,9±12,3 лет). Средний возраст группы здоровых – 47,6±8,11 лет. Среди обследованных преобладали женщины над мужчинами (58% vs 42%). Базисная терапия ИБС и АГ включала β-адреноблокаторы, ИАПФ, статины и препараты ацетилсалициловой кислоты в среднетерапевтических дозах.
Оценка распределения аллельного полиморфизма гена ITGA2 у больных выявила наличие гомозигот по 1-й аллели (С/С) — 30,7%, гомозигот по 2-й аллели (Т/Т) — 22,7% и гетерозигот (С/Т) в 46,6% случаев. Среди здоровых преобладали гомозигот по 1-й аллели (С/С) в 80%случаев и лишь в 20% случаев гетерозигота (С/Т). Нами не выявлено гомозигот по 2-й аллели (Т/Т) среди здоровых лиц. Таким образом, у большинства (77,3%) больных была обнаружена нуклеотидная замена в гене ITGA2 хотя бы в одной из хромосом, в то время как среди здоровых лиц, напротив, не наблюдалось гомозигот по Т аллели, а преобладали гомозиготы по аллели С.
Таблица 1
Распределение типа агрегации по полиморфизму ITGA2
|
Тип агрегации |
Итого | ||||
| Гиперагрегация | Гипоагрегация | Норма | |||
| Генотип | СС | 11(35,5%) | 7(22,6%) | 13(41,9%) | 31 |
| СТ | 24(57,1%) | 8(19,1%) | 10(24,8%) | 42 | |
| ТТ | 13(68,4%) | 3(15,8%) | 3(15,8%) | 19 | |
| Итого | 48 | 18 | 26 | 92 | |
Распределение типа агрегации тромбоцитов по полиморфизму (табл. 1) ITGA2 показала преобладание среди пациентов с повышенной агрегацией тромбоцитов генотипов С/Т и Т/Т. Пациенты с гипоагрегацией характеризовались практически равномерным распределением генотипа С/С и Т/Т. Нормальные параметры агрегации тромбоцитов были выявлены преимущественно у пациентов с С/С генотипом.
Распределение типов агрегации между различными генотипами было проверено парным t-тестом. Различия в распределении типов агрегации оказались статистически не значимыми (СС-СТ: p=0,1; CC-TT:p=0,05; CC-TT:p=0,4).
Оценка спонтанной и АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов не выявила значимых различий в распределении типов агрегации между различными генотипами (χ2=0,17).
Распределение показателей агрегации у пациентов с полиморфизмом ITGA2 было проверено на нормальность методом Колмогорова-Смирнова. Данные имели ненормальное распределение, поэтому для выявления достоверности различий в показателях агрегации тромбоцитов был использован тест Крускала-Уоллиса. Тест показал статистически значимые различия в показателях спонтанной агрегации тромбоцитов (p=0,01) и отсутствие различий при индукции агрегации тромбоцитов АДФ.
Для выявления достоверности различий в спонтанной агрегации тромбоцитов был использован однофакторный дисперсионный анализ, парный t-тест (с поправкой Бонферрони, различия считались статистически значимыми при p<0,17(0,05/3)) и тест Тьюки. Выявлено наличие статистически значимых различий в показателях спонтанной агрегации тромбоцитов (p<0,001). По данным парного t-теста между генотипами СС и СТ статистически значимых различий не было выявлено (p=0,55), генотип ТТ статистически значимо отличался как от генотипа СС (p<0,001), так и от генотипа СТ (p=0,001). Тест Тьюки также подтвердил значимые отличия в спонтанной агрегации тромбоцитов для носителей генотипа ТТ по сравнению с СТ и СС. Разница в среднем размере агрегата составила 1,0253311 (95% ДИ: 0,4 -1,65) для СС и ТТ, и 0,9 (95% ДИ: 0,30-1,49) для СT и ТТ.
Обсуждение.
Выявление генетических факторов и оценка их вклада в развитие ССЗ являются основными задачами современной молекулярной кардиологии. Данные литературы о связи различных полиморфных маркеров генов-кандидатов с эффективностью терапии основными классами антитромбоцитарных препаратов немногочисленны, а вопрос о целесообразности мониторирования лабораторной эффективности аспирина у отдельных категорий пациентов и/или индивидуализировать дозировку остается открытой [15].
В последние годы активно обсуждается проблема недостаточной активности терапии ацетилсалициловой кислотой [4, 5, 11], находящая свое отражение в повышенной агрегационной активности тромбоцитов на фоне приема препаратов ацетилсалициловой кислоты.
Имеются данные о том, что наибольшая частота аспиринорезистентных наблюдается среди больных инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST, что коррелирует с высоким уровнем АДФ в крови [20]. Есть основания полагать, что резистентность к терапии может быть связана с полиморфизмом гена циклооксигеназы, затрагивающим активный центр фермента (Ser529), полиморфизмом генов, кодирующих другие ферменты, участвующие в мобилизации и метаболизме арахидоновой кислоты (фосфолипазы, тромбоксансинтетазы) и полиморфизмом генов, кодирующих другие ГП рецепторы тромбоцитов [1, 3].
Одной из возможных причин сохранения повышенной агрегационной активности тромбоцитов у пациентов на фоне антиагрегантной терапии является преобладание среди них лиц с повышенной экспрессией рецепторов GPIa/IIa.
Известно, что индуцируемые реакции тромбоцитов пропорциональны количеству формирующихся комплексов агонист-рецептор. Ответ на антиагрегантные лекарственные препараты будет зависеть от плотности соответствующих рецепторов на мембране тромбоцитов. Исследования антагонистов GP IIb-IIIa рецепторов показали, что интенсивность тромбоцитарной агрегации строго коррелирует с количеством свободных рецепторов на поверхности клеток [2]. Для проверки гипотезы о связи повышенной агрегации тромбоцитов с геном, кодирующим интегин альфа 2, мы провели изучение связи агрегации тромбоцитов у принимающих препараты ацетилсалициловой кислоты с аллельным полиморфизмом гена ITGA2. Полученные результаты исследования свидетельствуют о преобладании аллеля Т у пациентов с повышенной спонтанной агрегацией тромбоцитов(p<0,05). Однако значимых различий в распределении типов АДФ индуцированных агрегаций между различными генотипами выявлено не было, что, возможно, связано с недостаточным объемом выборки.
Таким образом, в настоящее время не представляется возможным выделить генетические предикторы эффективности применения того или иного антиагреганта требуется проведение дальнейших исследований, а наличие выявление конкретного «неблагоприятного» полиморфного аллеля (Т-аллеля) является только вероятностным показателем, значение которого нельзя переоценивать.
Список литературы:
- Гарькина С.В., Дупляков Д.В., Павлова Т.В.Проблемы применения антитромбоцитарной терапии в кардиологии. // Эффективная фармакотерапия. 2012; 1: С. 24–27
- Мазуров А.В. Физиология и патофизиология тромбоцитов.-М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.- 480 с.
- Тупицына Т.В. Антиагрегантная терапия при ИБС. Некоторые проблемы и решения. // Кардиология. 2010; 50(6). — С. 4-21.
- Ушкалова Е.А. Новые пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов: компьютерное моделирование и синтез. // Молекулярная медицина №2, — 2012.- С. 21-26.
- Шилов А.М. Ацетилсалициловая кислота – антиагрегант для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. // ПМГМУ им. И.М.Сеченова. Журнал «Трудный пациент». Москва. № 4 — 2013. — С.25-30.
- Furihata K. Influence of platelet collagen receptor polymorphisms on risk for arterial thrombosis / K. Furihata, D. J. Nugent, T. J. Kunicki // Arch. Pathol. Lab. Med. – 2002. – Т. 126 – 305–309с.
- Gawaz M., Blood Platelets-clinical relevance. Stuttgart: George Thieme Verlag, 2010.
- Gonzales-Conejero R., Rivera J., Corral J. et al. Biological assessment of aspirin efficacy on healthy individuals: heterogeneous response or aspirin failure? Stroke 2005; 36: 276-280.
- Grundmann K, Jaschonek K, Kleine B et al. Aspirin non-responder status in patients with recurrent cerebral ischemic attacks. J Neurol 2003; 250: 63-6.
- Gum PA, Kottke-Marchant K, Welsh PA et al. A prospective, blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 961-5.
- Hart R.G., Pearce L.A., Aguilar M.I. Mtta-analysis antithrombotic therapy to prevent stroke in patients who have nonvalvular atrial fibrillation. Ann.Inter.Med. 2007; 146: 12: Р. 857–867.].
- Lepantalo A., Mikkelsson J., Resendiz J.C. et al. Polyhmorphisms of COX-1 and gpf 1 associate with the antiplatelet effect of aspirin in coronary artery disease patients. Thrombosis Haemostasis, 2006; 95: 253259.
- Maree O., Curtin R.J., Chubb A. et al. Cyclooxygenase-1 haplotype modulates platelet response to aspirin. Thrombosis Haemostasis, 2005; 3: 2340-2345.
- Matsubara Y., Murata M., Maruyama T. et al. Association between daibethic retinopaty and genetic variation in alpha2 beta integrin, a platelet receptor for collagen. Blood 2000; 95: 1560-1564.
- Mehta L., В. Mohandas. Aspirin resistance: fact or fiction? A point of view. World Journal of Cardiology 2010; 26 (9): 280-288.
- Michelson A.D., Cattaneo M., Eikelboom J.W. et al. Aspirin Resistance: position paper of the Working Group on Aspirin Resistance. J. Thromb Haemost 2005; 3: 1309-1 1.
- Mueller M.R., Salat A., Stangl P. et al. Variable platelet response to low- dose ASA and the risk of limb deterioration in patients submitted to peripheral arterial angioplasty. Thromb. Haemost 1997; 78:1003-7.
- Rivera J. Platelet receptors and signaling in the dynamics of thrombus formation / J. Rivera, M. L. Lozano, L. Navarro-Núñez, V. Vicente // Haematologica – 2009. – Т. 94 – № 5 – 700–711с.
- Shen H., Herzog W., Drolet M.A., et al. Aspirin resistance in healthy drug-naïve men versus women (from the Heredity and Phenotype Intervention Heart Study). Am J Cardiol. 2009 ; Epub ahead of print.
- Zimmerman N., Wenk A., Kim U. et al. Functional and biochemical evaluation of platelet aspirin resistance after coronary artery bypass surgery // Circulation. – 2003. – Vol.108. – P.542-547.[schema type=»book» name=»ГЕН РЕЦЕПТОРА КОЛЛАГЕНА ПРИ ОЦЕНКЕ АГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ» description=»Статья посвящена изучению агрегации тромбоцитов у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) и установлению роли генетического фактора в поддержании повышенной агрегационной активности тромбоцитов у пациентов на фоне приема препаратов ацетилсалициловой кислоты (АСК) путем выявления полиморфизма гена с помощью ДНК, выделенной из цельной крови пациентов с использованием набора «ДНК-Экспресс» («Литех»,Россия). Установлено преобладание Т-аллеля рецептора коллагена ITGA2 у пациентов с повышенной спонтанной агрегационной активности тромбоцитов. Исследование показало преобладание среди пациентов с повышенной агрегацией тромбоцитов генотипов СТ и ТТ. Нормальная агрегационная активность тромбоцитов выявлена преимущественно у пациентов с СС генотипом. » author=»Рузов В.И., Алтынбаева Э.Н., Низамова Л.Т.» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-02-24″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_25.07.15_07(16)» ebook=»yes» ]