Ишемия внутренних органов является одной из самых актуальных проблем в медицине[1,3,7]. В этой связи ишемия поджелудочной железы представляет несомненный интерес [2,5].
Целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение структуры поджелудочной железы на разных сроках ишемии. В качестве объекта исследования была выбрана крыса. Исследование поджелудочной железы проводилось на крысах методами ЭПР- и ЯМР-спектроскопии, гистологическими методами, а также электронной микроскопией.
Материалы и методы исследования
Изучали морфологию поджелудочной железы крысы на различных сроках ишемии органа. После внутримышечного введения рометара в дозе 0,2мл/кг срединной лапаротомией вскрывалась брюшная полость. В операционную рану выводили желудок, печень, выделяли и перевязывали чревную и краниальную брыжеечную артерию на различные сроки от 0 до 90 минут (сроки перевязки сосудов 5, 15, 30, 60, 90 минут). В качестве контроля были использованы 3 крысы, которым была произведена лапаротомия, а лигатуры на артерии, кровоснабжающие поджелудочную железу не накладывались.
Из поджелудочной железы вырезались кусочки размером 0,3 см³. Полученный таким образом материал разрезали на 2 части. Одну половину фиксировали в 10% нейтральном формалине по Лилли или жидкости Карнуа и после соответствующей проводки (обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации и замещение спирта ксилолом) заливали в парафин. Вторую половину использовали для изготовления криостатных срезов и электронной микроскопии.
При ЭПР-спектроскопии ишемизированные кусочки поджелудочной железы подвергались замораживанию жидким азотом и стандартизировались с помощью пресс-формы. Спектры ЭПР регистрировались на ЭПР спектрометре SE/X-2544 фирмы «Радиопан» (Польша) с рабочей частотой 9400 мГц (Х-диапазон), шириной протяжки магнитного поля 2000 гаусс. Сигнал ЭПР записывался в виде первой производной линии максимального наклона в миллитеслах (мТ) поглощения. Полуширина линии измерялась между точками максимального наклона. Для сравнительной оценки спектров ЭПР был выбран g-фактор (точка наивысшего резонанса).
ЯМР-спектроскопия проводилась при комнатной температуре на ЯМР-спектрометре MSL-400 фирмы «Брукер» (Германия), на частоте 161.9 мГц., магнитное поле 9,395 тесла. После экспериментальной ишемии поджелудочная железа извлекалась из брюшной полости, разрезалась на кусочки, которые стандартизировались по объему пробирки. Тотчас же проводилась ЯМР-спектроскопия. Нами исследованы образцы поджелудочной железы в контроле, и далее через 5, 15, 30, 60, 90 минут ишемии. В ЯМР-спектрах тканей определялись неорганический фосфор (+5ррm) и фосфокреатин (0ppm), а также промежуточные фосфорные образования, участвующие в синтезе фосфолипидов мембран, которые сформированы главным образом глицерофосфорилхолином (GPC) и глицерофосфорилэтаноламином (GPE). Это продукты катаболизма мембран клеток. Они располагаются на отметке 3-3,3ppm. Спектр нуклеозидтрифосфата состоял из трех сигналов фракций : γ-фракция — 3 ppm, α-фракция -8ppm, β-фракция -16ppm. С помощью ЯМР-спектроскопии получили спектры данных соединений в поджелудочной железе и проследили их динамику в зависимости от степени ишемии органа.
Полученные спектры идентифицировались в сравнении со спектрами, полученными Felix Wehrli и W. Semmler [6,8].
Для электронномикроскопического исследования материал фиксировали в забуференном 2,5% растворе глутаральдегида при температуре 4˚С в течение 1 часа, дофиксировали в забуференном 1% растворе ОsO2 в течение 2 часов, обезвоживали и заливали в ЭПОН-812. Ультратонкие срезы переносили на опорные сетки и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Изучение объектов проводили в электронном микроскопе «ЭММА-4».
Результаты и обсуждение
Рутинные гистологические методы исследования не выявили изменения в сосудах и паренхиме поджелудочной железы на ранних сроках ишемии. Отчетливые изменения, в том числе участки некроза, появляются только через 60 минут ишемии (рис.1).
С помощью электронной микроскопии можно выявить в кровеносном русле нормальной поджелудочной железы клетки эндотелия, базальную мембрану, коллагеновые волокна (рис.2).
Через 5 минут ишемии определяется набухание базальных мембран, отек субэндотелиального пространства с разволокнением на отдельных участках коллагеновых волокон. Эндотелиоциты при этом выбухают в просвет сосудов, в их цитоплазме обнаруживаются в большом количестве пиноцитозные пузырьки, увеличиваются и набухают митохондрии. В ядрах эндотелиальных клеток увеличивается содержание диспергированного хроматина за счет уменьшения плотного. Ядра часто имеют неровный контур с многочисленными выемками (рис.3). Указанный процесс определяется как «активация эндотелия».
Рис. 3. Поджелудочная железа крысы. «Активация эндотелия» через 5 мин. ишемии: Эн – эндотелий; БМ – базальная мембрана; ПП – пиноцитозные пузырьки. Электронограмма Х 10000.
С помощью ЭПР-спектроскопии в нормальной поджелудочной железе удалось определить сигналы с g-факторами 1,94, 1,92 и 1,89, исходящими от железосерных белков, а также сигнал с g-фактором 2,025, исходящим от окисленного центра сукцинаткоэнзимредуктазы [3,4],
ЭПР-спектроскопия уже через 5 минут ишемии выявляет увеличение интенсивности сигналов с g=1,94, g=1,92 и 1,89 и уменьшение сигнала с g=2,025. При увеличении продолжительности ишемии до 30 минут отмечается дальнейший рост интенсивности сигнала с g=1,94,g=1,92 , g=1,89 и снижение интенсивности сигнала с g=2,025. Через 60 минут ишемии интенсивность сигналов g=1,94, g=1,92, g=1,89 значительно увеличивалась, а выраженность сигнала с g=2,025 снижалась, что и отражено на рисунке 4.
Полученные данные отражают негативные процессы, происходящие в митохондриальной дыхательной цепи.
Рис.4. Динамика изменений интенсивности сигналов с g-факторами 2,025, 1,94,1,92 и 1,89 через 5,30,60 минут ишемии.
ЯМР-спектроскопия позволяет выявить в паренхиме нормальной поджелудочной железы интенсивный сигнал, исходящий от фосфокреатина и незначительный сигнал от неорганического фосфата, α, β, γ- фракции АТФ [8].
Через 5 минут ишемии определяется снижение, по сравнению с контролем, интенсивности сигнала от фосфокреатина, γ- фракции АТФ и увеличение интенсивности сигнала от неорганического фосфата.
Через 30 минут ишемии наблюдается дальнейшее снижение интенсивности сигнала от фосфокреатина, γ- фракции АТФ и увеличение интенсивности сигнала от неорганического фосфата.
Увеличение продолжительности ишемии приводило к росту интенсивности сигнала от неорганического фосфата и уменьшению выраженности сигнала от фосфокреатина и γ- фракции АТФ. Это свидетельствовало об ухудшении энергетического метаболизма. Динамика изменений ЯМР-спектров поджелудочной железы на фоне ишемии отражена на рисунке 5.
Рис.5. Динамика изменений ЯМР-спектров поджелудочной железы через 5,30,60 минут ишемии.
Выводы
1.ЭПР-спектроскопия позволяет выявить изменения в поджелудочной железе кошки уже через 5 минут после прекращения артериального кровотока, по мере развития ишемических повреждений отмечается увеличение интенсивности сигналов от железосерных белков, а также снижение её от окисленного центра сукцинат-коэнзимредуктазы, что свидетельствует о негативных сдвигах в митохондриальной дыхательной цепи.
2 ЯМР — спектроскопия выявляет изменения в поджелудочной железе через 5 минут ишемии, На фоне продолжающейся ишемии отмечается снижение интенсивности сигнала от фосфокреатина, γ- фракции АТФ и рост интенсивности сигнала от неорганического фосфата, что говорит об ухудшении энергетического метаболизма.
3.Морфологические изменения в кровеносном русле поджелудочной железы при ишемии начинаются с ультраструктурных изменений в эндотелии, которые можно определить через 5 минут ишемии.
4.Классические гистологические методы исследования не позволяют выявить изменения в сосудах и паренхиме поджелудочной железы на ранних сроках ишемии.
Литература
- Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов / М.В. Биленко. – М.: Медицина, 1989. – 368 с.
- Ефимов А.Л. Прогностические критерии тяжести острого панкреатита в зависимости от изменения показателей микроциркуляции / А. Л. Ефимов; И. В. Гайворонский, С.В. Петров // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 11, Медицина. — 2006. — Вып. 1. — С. 94 – 101.
- Рууге Э.К. Редокс — состояние переносчиков электрон – транспортной цепи митохондрий сердца в условиях перфузии – ишемии – реперфузии: исследование методом низкотемпературной ЭПР — спектроскопии / Э.К. Рууге, В.Л. Лакомкин, А.А. Тимошин // Биофизика, Т 42, № 6, — 1997. –С. 1240-1245.
- Тимошин А.А. Влияние ишемического прекондиционирования на свободнорадикальные центры изолированного сердца крысы при ишемии и на ранней стадии реперфузии / А.А. Тимошин, В.Л. Лакомкин, Э.К. Рууге // Биофизика, – 2000. – Т 45, — № 1, – С.112 -118.
- Ahmed S. Acute pancreatitis during sickle cell vaso-occlusive painful crisis / Ahmed S., Siddiqui A.K., Siddiqui R.K. et al // Am J Hematol. – 2003. – Jul, 73 (3). — p. 190-193.
- 6. Felix Biomedical magnetic resonance imaging / W. Felix, D. Shaw, J. Bruce. — Kneeland VCH Publishers Jnc., 1988. — 601 p.
- Shuning Huang et al. Molecular MRI of Acute Necrosis with a Novel DNA-Binding Gadolinium Chelate: Kinetics of Cell Death and Clearance in Infarcted Myocardium /Circ Cardiovasc Imaging. 2011 Nov; 4(6): 729–737.
- Semmler W. In vivo magnetic resonance spectroscopy: basic principles and clinical applications in oncology / Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, 2005. — p. 157-171.[schema type=»book» name=»ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДОВ ЯМР И ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ В ОПРЕДЕЛЕНИИ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА РАННИХ СРОКАХ ИШЕМИИ» author=»Кадыров Ренат Каримович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-04-03″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.04.2015_04(13)» ebook=»yes» ]