В процессе производства терапевтических рекомбинантных белков необходимо проведение контроля качества и оценки их стабильности. Это обусловлено высокой чувствительностью рекомбинантных белков к факторам окружающей среды, что требует соблюдения строгих условий хранения. Поэтому оценка стабильности должна проводиться не только готовой лекарственной формы лекарственного средства, но и ее полупродуктов для гарантии безопасности и эффективности фармацевтического продукта и обеспечения оптимального производственного процесса [8, 10].
В ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» была разработана терапевтическая вакцина против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза. Готовая вакцина представляет собой стерильную суспензию для инъекций, которая содержит в прививочной дозе (0,5 мл) гибридные рекомбинантные белки (слитые последовательности онкобелка Е7 ВПЧ (типов 6 и 11) и белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis (200 мкг)), сорбированные на алюминия гидроксиде (не более 1,25 мг алюминия/на 1 дозу) [2, 3].
Долгосрочные испытания стабильности рекомбинантных белков, входящих в состав готовой лекарственной формы, необходимы для подтверждения адекватности разработанного проекта спецификации основным свойствам исследуемого объекта [7, 8].
Целью в долгосрочных исследованиях является оценка стабильности основных физико-химических свойств гибридных рекомбинантных белков Е7(6)-HSP70 и Е7(11)-HSP70 при специфицированной температуре хранения [1, 6, 8].
Разработанная программа исследования стабильности включала определение критических свойств целевых белков, которые чувствительны к условиям хранения, и мониторинг физико-химических и биологических параметров, которые гарантируют отсутствие изменений качества препарата [6, 8, 9].
Разработка программы оценки стабильности осуществлялась в соответствии с международными и отечественными требованиями (Табл.) [4, 5, 8].
Для проведения испытаний были наработаны 3 серии субстанции гибридного рекомбинантного белка Е7(6)-HSP70 и 3 серии субстанции гибридного рекомбинантного белка Е7(11)-HSP70. По внешним признакам это плотная беловатого цвета масса, затвердевающая при температуре минус (20 ± 2) ºС. Полученные полупродукты готовой лекарственной формы терапевтической вакцины были упакованы по 50 мл в стерильных контейнерах вместимостью 60 мл из полиэтилентерефталат-гликоля с резьбовым колпачком из полиэтилена высокой плотности.
На хранение закладывали количество субстанции, рассчитанное в соответствии с программой оценки стабильности с запасом не менее 50 %, составляющим арбитражные и контрольные образцы. Тестировали препараты с интервалом 3 месяца (Таблица).
В соответствии с рекомендациями ICH Q5C специфицированные параметры качества рекомбинантных белков, которые не связаны с биодеградацией препарата (ДНК штамма-продуцента, белки штамма-продуцента, стерильность) не контролировали в промежуточных точках, но оценивали при выходном контроле продукции и по окончании и продлении срока годности [8].
Для каждой тестируемой серии составляли индивидуальный план-график тестирования, содержащий информацию о датах (месяц и год) тестирования и объеме выполняемых анализов.
Проведенные исследования показали, что специфицируемые показатели качества субстанций не выходили за нормированные пределы, обеспечивая стабильность белка в заявленной первичной упаковке на протяжении всего срока годности и его продления. Срок годности на основании экспериментальных данных по всем специфицированным параметрам рекомбинантных белков Е7(6)-HSP70 и Е7(11)-HSP70 составил 12 месяцев.
Список литературы.
- Государственная Фармакопея Российской Федерации ХII. Часть I. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения; 2008.
- Козлов Д.Г., Чеперегин С.Э., Губайдуллин И.И., Ефремов Б.Д., Тюрин О.В., Залунин И.А. Способ получения белка Е7-HSP70 и штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae для его осуществления. Патент РФ № 2489481, 2013.
- Кухаренко А.Е., Гаврилова Н.А., Гравель И.В., Хамитов Р.А. Технология получения и контроль качества терапевтической вакцины против ВПЧ-ассоциированных заболеваний// Сеченовский вестник № 2(16) 2014 г. С. 91.
- Кухаренко А.Е., Гаврилова Н.А., Сауткина Е.Н., Гравель И.В., Хамитов Р.А. Методические подходы к контролю качества терапевтических вакцин против ВПЧ-ассоциированных заболеваний// Биопрепараты. 2014; (4): 14-23.
- Кухаренко А.Е., Гравель И.В., Гаврилова Н.А. Методы контроля подлинности инновационной терапевтической вакцины на основе композиции рекомбинантных белков Е7-HSP70// Сборник материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации». Санкт-Петербург. 20 ноября 2013 г. – СПб.: Изд-во СПХФА, 2013. С. 152-153.
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А.Н. Миронова. — М.: Гриф и К, 2012. — 536 с.
- ICH Topic Q1 (R2) Stability testing guidelines: Stability testing of new drug substances and product (CPMP/ICH/380/95)
- ICH Topic Q5C Stability testing of biotechnological/biological products (CPMP/ICH/138/95)
- ICH Topic Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (CPMP/ICH/365/96).
- WHO Guidelines on the quality, safety, and efficacy of biotherapeutic protein products prepared by recombinant DNA technology.
Таблица. Испытание стабильности гибридных рекомбинантных белков Е7(6)-HSP70 и Е7(11)-HSP70
| Наименование показателя | Метод испытания | Спецификация | Частота и период контроля хранения, месяц | |||||
| 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 12+1 | |||
| Описание | ГФ XII, визуальный | Прозрачный, бесцветный раствор | + | + | + | + | + | + |
| Подлинность | Вестерн-блот | Подвижность основных полос испытуемого образца должна соответствовать подвижности полос стандартного образца предприятия. | + | + | + | + | + | + |
| Прозрачность раствора | ГФ XII, визуальный | Должна быть прозрачной | + | + | + | + | + | + |
| Цветность раствора | ГФ XII, визуальный | Должна быть бесцветной по сравнению с водой. | + | + | + | + | + | + |
| рН | ГФ XII, потенциометрический | От 7,0 до 7,6. | + | + | + | + | + | + |
| Содержание белка | ГФ XII, метод с бицинхиноновой кислотой | Не менее 1,0 мг/мл | + | + | + | + | + | + |
| Посторонние примеси | Электрофорез в ПААГ в восстанавливающих условиях с окраской Кумасси R-250 | Интенсивность основной полосы должна составлять не менее 95% | + | + | + | + | + | + |
| Электрофорез в ПААГ в невосстанавливающих условиях с окраской Кумасси R-250 | Суммарная интенсивность основных полос должна составлять не менее 95% | + | + | + | + | + | + | |
| Чистота | ВЭЖХ, гель-фильтрация | Суммарное содержание основного вещества в двух пиках не менее 97,0 % | + | + | + | + | + | + |
| ДНК штамма-продуцента | Иммуноферментный анализ с использованием Threshold системы | Не более 20,0 пг на 1,0 мкг белка
|
+ | — | — | — | + | + |
| Белки штамма-продуцента | Иммуноферментный анализ | Не более 0,1 нг на 1,0 мкг белка. | + | — | — | — | + | + |
| Стерильность | ГФ ХII, метод мембранной фильтрации | Должна быть стерильной. | + | — | — | — | + | + |
| Бактериальные
эндотоксины |
ГФ ХII, качественный анализ (Метод А) | Не более 20 ЕЭ / мг белка | + | + | + | + | + | + |
| Аномальная токсичность | ГФ ХII, биологический
|
Должна быть нетоксичной. | + | + | + | + | + | + |
| Полисорбат 80 | ВЭЖХ, обращенно-фазовая хроматография | Не менее 0,002 % и не более 0,008 %. | + | + | + | + | + | + |
Обозначения: + — испытания показателя проводятся; — испытания показателя не проводятся[schema type=»book» name=»ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ГИБРИДНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Е7-HSP70″ author=»Кухаренко Андрей Евгеньевич, Гаврилова Наталья Андреевна, Ловцова Любовь Валерьевна, Гравель Ирина Валерьевна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-06-16″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)» ebook=»yes» ]