ПЕРВЫЙ СРЕДИ РАВНЫХ. ОДИН ИЗ САМЫХ ЭКСПРЕСНЫХ И ДОСТУПНЫХ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ — БАКТЕРИАЛЬНО ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТЕСТ

Основными преимуществами люминесцентного бактериального теста перед другими биотестами являются:

экспрессность анализа (время анализа 5 – 30 мин);
безвредность технологии;
количественная оценка анализа, точность и воспроизводимость результатов (ошибка не более 10%);
удобство и простота анализа (небольшое число вспомогательных подготовительных операций, автоматическое определение индекса токсичности исследуемых ксенобиотиков с помощью современных люминометров);
оценка метаболического статуса бактериальной клетки, как целостного организма, а не только показателя функционирования люминесцентной системы;
корреляция полученных данных действия различных токсических веществ с использованием бактериальной люминесценции и общепринятых тестов, включая разные высшие организмы (коэффициент корреляции (ЕС₅₀ с ЛД₅₀) от 0.8 до 0.95);
стабильность и стандартность люминесцентного биотеста (лиофильновысушенные клетки биотеста в виде стандартных партий пригодны для анализа в течение 6 месяцев при хранении +4⁰С; после регидратирования биотест стабилен по свечению);
малый объем анализируемого образца (1 мл – 0.1 и менее);
свидетельство о характере токсического действия ксенобиотиков: при увеличении показателей токсичности во времени — аккумулирование эффекта, аддитивное или синергическое действия, а при уменьшении показателей токсичности — временное токсическое действие;
косвенное свидетельство химической природы исследуемого ксенобиотика по изменению во времени показателей его токсического действия: усиление токсичности предполагает наличие в исследуемом образце токсичного тяжелого металла, а усиление с последующей стабилизацией или с некоторым последующим снижением токсичности предполагает наличие в исследуемом образце токсичного органического соединения;
возможность не только быстро и экономно определить токсичность ксенобиотика, но и выяснить, насколько стабильны по токсичности ксенобиотики во времени и токсичны ли продукты их деградации во времени в различных исследуемых средах (например, пестициды в почве);
возможность экспрессно оценивать действие как физических факторов (например, биологические эффекты действия ионизирующей радиации, нетеплового электромагнитного излучения, так и химических веществ, и их смесей;
широкая возможность проведения анализа и санитарно-гигиенического контроля в лабораторных и полевых условиях для регулярного мониторинга в режиме реального времени или в системе on-line.

Однако при всех достоинствах биотестирования на основе бактериального люминесцентного тест-обьекта следует указать на некоторые его недостатки, которые устраняются совершенствованием методов анализа (приведены ниже):

разница pH в контроле и исследуемом образце;
окрашенные растворы (яркая окраска);
наличие осмопротектора (например, у природных морских тест-обьектов — биосенсоров;
температурные ограничения (~не выше 15-20⁰С) проведения анализа (например, используемые на практике природные морские тест-объекты);
во многих случаях одновременно анализируют небольшое число проб (отсутствие маштабируемости);
затруднительно оценить истинную токсичность ксенобиотика (отсутствие острой, непосредственно проявляющейся токсичности) в случае проявления отдаленных последствий токсичности (хроническое действие на репродуктивность или метаболические, медленно проявляющиеся реакции, то есть отсроченная токсичность во времени);
отсутствие прямой связи высокой токсичности ксенобиотика и выживаемости клеток тест-обьекта (только цитоцидные ксенобиотики вызывают летальность клеток тест-объекта, а высокая токсичность нецитоцидного действия токсичного ксенобиотика может прямо не влиять на выживаемость клеток тест-объекта).

К настоящему времени совершенствуют методы биотестирования на основе бактериальной люминесценции, которые позволяют преодолеть указанные выше недостатки и ограничения биотестирования:

Метод биотестирования на основе люминесцентных бактерий позволяет проводить анализы в достаточно широком диапазоне pH (от 6.0 до 7.7). Однако в анализах рекомендовано использовать стандартные значения исследуемых растворов при pH близких 7 (7.0-7.6).

Усовершенствованием метода для стандартизации pH контрольных и исследуемых образцов является использование определенного буфера.

Для определения токсичности цветных образцов некоторыми исследователями предложен модифицированный метод биотестирования, связанный с изменением процедуры анализа.

Наличие осмопротектора для морских клеток тест-обьекта (например, тест-система «Микротокс») может приводить к ложноположительным или ложноотрицательным результатам анализа. В связи с этим обстоятельством в настоящее время в анализах используют генно-инженерные штаммы бактерий с созданным светящимся фенотипом (например, такие как Escherichia coli тест-системы «Эколюм»), не требующие осмопротектора. Кроме того, имеется потребность в природных микроорганизмах, позволяющих использовать их в качестве биолюминесцентных биосенсоров без осмопротектора, например, таких как светящиеся почвенные бактерии Photorhabdus luminescens. В МГУ им. М.В. Ломоносова на кафедре миеробиологии проводят работы по разработке тест-системы на основе Photorhabdus luminescens. Однако следует отметить, что для широкого использования в биотестировании еще не разработана удобная тест-система на основе этих бактерий.

При использовании метода биотестирования в широком диапазоне температур (28-37⁰С) также перспективно использование созданных генно-инженерных штаммов бактерий со светящимся фенотипом (например, Escherichia coli с клонированным lux-опероном Ph. luminescens). Перспективу представляют и природные бактерии Ph. luminescens — единственные известные почвенные люминесцентные бактерии. Их использование позволяет проведение анализа при более высокой температуре (до 37⁰С).

Для совершенствования возможностей маштабируемости анализов при биотестировании вводят в процедуры анализа уменьшение объема проб, используя микропланшеты при автоматизации получения результатов анализов.

Выращивание в жидкой питательной среде клеток тест-объекта позволяет оценить истинную токсичность ксенобиотика в случае проявления отдаленных последствий токсичности, а именно хроническое действие токсиканта на репродуктивность или метаболические, медленно проявляющиеся реакции клеток.

Действие высокой токсичности ксенобиотика может быть связано с цитотоксическим (может проявляться полным подавлением интенсивности люминесценции – высоким индексом токсичности) или цитоцидным (убитые клетки не светятся) действием на тест-организм. При необходимости этот показатель следует определить дополнительным анализом (например, подсчетом выживаемости бактерий по числу КОЕ или другим методом. Например, так была установлена разница во времени бактерицидного действия ионного и коллоидного серебра.

В заключение следует подчеркнуть, что биотестирование на основе бактериальной люминесценции несомненно ценно и превосходит по доступности из-за изложенных достоинств для практического и исследовательского применения. В последние десятилетия создают и специфические бактериальные люминесцентные тесты, с чувствительными промоторами к определенным веществам. Очевидно, что у них хорошая перспектива.

Неизменна потребность в природных люминесцентных биотестах, так как остается дискуссионным вопрос о безопасности использования генно-инженерных штаммов без риска сброса их в природную среду. В этом плане актуально создание стандартного люминесцентного биосенсора на основе единственных представителей природных почвенных светящихся бактерий Ph. luminescens. Они безопасны для практического использования и лишены многих недостатков тест-объектов на основе природных морских светящихся бактерий. Биотест с использованием почвенных светящихся бактерий Ph. luminescens — симбионтов энтомонематод и паразитов насекомых, перспективен для использования в биотестировании в медицинских исследованиях (клетки бактерий имеют толстые слизистые оболочки клеток, типичные для патогенных бактерий) и оценки загрязнения почв (почвенная экосистема нуждается в быстром мониторинге ее безопасности).

Наряду с этим следует отметить, что необходимо уделить особое место использованию в биотестировании «батарее» тестов, учитывая, что многие организмы могут отличаться чувствительностью к разным токсикантам. Любые стандартные люминесцентные биосенсоры могут использоваться как самостоятельно, так и при включении их в «батареи» биотестирования с общепринятыми тест-организмами.

Список литературы:

Методики измерений интегральной токсичности воды, почв, воздуха, материалов и изделий имеют свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93), зарегистрированы в Департаменте Госсанэпиднадзора РФ (№№ 11-1/131-09, 11-1/132-09, 11-1/133-09, 11-1/134-09) и Госкомэкологии (сертификат Госстандарта России № 01.19.231/2001). Методики измерений интегральной токсичности №№ 11-1/131-09, 11-1/132-09, 11-1/133-09, 11-1/134-09 свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93), Департамент Госсанэпиднадзора РФ) свидетельство о метрологической аттестации Госкомэкологии сертификат Госстандарта России № 01.19.231/2001.
Backhaus T., Froehner K., Altenburger R., Grimme L. H. Toxicity testing with Vibrio fischeri: a comparison between the long term (24 h) and the short term (30 min) bioassay.// Chemosphere. 1997. V.35. P.2925-2938.
Bulich A. A., Tung K.-K., Scheibner G. The luminescent bacteria toxicity test: its potential use as an in vitro alternative. //Biolum. Chemilum. 1990. V. 5. № 2. P. 71–77.
Danilov V.S., Zarubina A.P, Eroshnicov G.E., Solov’eva L.N., Kartashev F.V., Zavil’gelsky G.B. The biolumiscent sensor systems with lux-operons from various species of luminescent bacteria. //Moscow University Biologocal Sciences Bulletin. 2002. №3. P. 20-24.
Kaiser K. L. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms // Environ. Health Perspect. 1998. Vol. 106. № 2. P. 583–591
Schmitz R.P.H., Kretkowski С., Eisentraeger A., Dott W. Ecotoxicological testing with new kinetic Photophabdus luminescens growth and luminescence inhibition assay in microtitration scale. //Chemosphere. 1999. V. 38. N 1. P.67-78.[schema type=»book» name=»ПЕРВЫЙ СРЕДИ РАВНЫХ. ОДИН ИЗ САМЫХ ЭКСПРЕСНЫХ И ДОСТУПНЫХ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ — БАКТЕРИАЛЬНО ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТЕСТ» description=»Среди разнообразных тест-обьектов для первичной оценки интегральной токсичности различных веществ и их смесей, новых материалов, включая наноструктурные, а также физические факторы следует отметить бактериальный люминесцентный тест, который по праву можно отнести к наиболее результативным и доступным из используемых биотестов. На сегодняшний день необходимо уделить особое место использованию в биотестировании «батареи» тестов, учитывая, что многие организмы могут отличаться чувствительностью к разным токсикантам. » author=»Зарубина А. П., Сорокина Е. В.» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-02-08″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_29.08.15_08(17)» ebook=»yes» ]

euroasia

Похожие записи