Номер части:
Журнал
ISSN: 2411-6467 (Print)
ISSN: 2413-9335 (Online)
Статьи, опубликованные в журнале, представляется читателям на условиях свободной лицензии CC BY-ND

ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС



Науки и перечень статей вошедших в журнал:
DOI:
Дата публикации статьи в журнале:
Название журнала: Евразийский Союз Ученых — публикация научных статей в ежемесячном научном журнале, Выпуск: , Том: , Страницы в выпуске: -
Данные для цитирования: . ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС // Евразийский Союз Ученых — публикация научных статей в ежемесячном научном журнале. Биологические науки. ; ():-.

Методы:

В работе использованы реактивы фирмы Sigma (США). В качестве экспериментальных животных служили  самцы и самки белых беспородных крыс 6-и и 10-и недельного возраста. Раствор цисплатина (Cis-DDP) вводили  внутрибрюшинно (10 мг/кг веса животного). Животных декапитировали через 48 часов после инъекции препарата. Выделение ядер производили по модифицированному методу Hewish at al [3, с. 505].

Ядра клеток печени осаждали  центрифугированием при 24000 g в течение 60 мин. Осадок очищенных ядер отмывали от избытка сахарозы в среде выделения с последовательным осаждением (центрифугирование 10 мин при 700 g).

Активность ПАРП 1 измеряли по убыли субстрата (НАД+) в реакционной среде, содержащей изолированные ядра клеток печени (плотность ядерной суспензии составляла  1мг/мл  по  ДНК), 1мМ CaCl2, 6 мМ MgCl2  в течение 10 мин. Реакцию  инициировали добавлением НАД+ к суспензии ядер. Через 10 мин реакцию останавливали путем осаждения ядер из реакционной среды центрифугированием (2 мин  8000 g, 370C). Количество остаточного НАД+ определяли в образцах надосадочной жидкости (50 мкл) по методу, основанному на колориметрическом определении окрашенного продукта реакции НАД+ с ацетофеноном (поглощение 378 нм) [4, с. 80]. Количество НАД+ определяли по калибровочной кривой.

Методом вестерн блоттинга идентифицировали ПАРП 1 и фрагменты специфического расщепления фермента. После переноса фракций электрофоретического разделения ядерных белков мембрану инкубировали в блокирующем растворе (10 мМ Трис HCl, pH 7,4; 150 мМ NaCl; 0,05%  Tween 20). Для предотвращения неспецифического связывания антител в инкубационный раствор добавляли  бычий сывороточный альбумин (BSA) и инкубировали при + 4°C, в течение ночи. Далее мембрану промывали 3 раза по 5 мин в инкубационном растворе (10 мМ Трис HCl, pH 7,4; 150 мМ NaCl; 0,05 %  Tween 20).

Первичные антитела ПАРП-1 вносили в раствор для инкубации мембран (1:2500). Через 2 часа (+4°C) несвязавшиеся первичные антитела удаляли промывкой мембраны инкубационным раствором. Далее мембрану выдерживали в течение 1 часа в инкубационном растворе, содержащем вторичные антитела (1:25000), конъюгированные со щелочной фосфатазой.

Достоверность различий между средними величинами полученных данных определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты:

В работе исследовалось действие цисплатина и аллостерического ингибитора  поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 (ПАРП 1) АТФ на активность фермента в ядрах клеток печени  самцов и самок 6-и  и 10-и недельных крыс.

Полученные данные выявили заметные половые различия в  активности ПАРП 1. Было показано, что в ядрах клеток печени неполовозрелых крыс самцов (6 нед.) базовая активность ПАРП 1 на 40% выше активности фермента печени крыс самок (рис. 1).

ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС

Рисунок 1. Действие цисплатина (10мг/кг, 48ч) на активность    ПАРП 1 в ядрах клеток печени неполовозрелых (6 нед.) крыс.

В ядрах клеток печени половозрелых крыс (10 нед.) различия в активности  ПАРП 1 у самок и самцов не наблюдаются. Однако у 10-и недельных крыс наблюдается уменьшение базовой активности фермента в 2.5-3 раза (рис. 2). Эксперименты показали, что после введения цисплатина 6-и недельным животным, активность ПАРП 1  самцов и самок уменьшается в различной степени (3,5 и 2 раза, соответственно). Однако введение цисплатина 10-и нед. крысам приводит к увеличению активности ПАРП 1 более чем в 2 раза независимо от пола животных (рис 2), что является ярким проявлением возрастных различий  действия цисплатина на активность фермента.

ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС

Рисунок 2. Действие цисплатина (10мг/кг, 48ч) на активность     ПАРП 1 в ядрах клеток печени половозрелых (10 нед.) крыс.

Во второй  серии экспериментов исследовалось влияние различных физиологических концентраций аллостерического ингибитора АТФ на активность ПАРП 1 в ядрах клеток печени. Результаты исследований показали, что у неполовозрелых крыс АТФ (1мМ) ингибирует активность фермента на 40%. У 10-и нед. животных проявляется половой диморфизм действия 1мМ АТФ  (активность ПАРП 1 в ядрах печени самок уменьшается на 45%, у самцов-на 10%). Более высокие физиологические концентрации АТФ (5мМ и 10 мМ) практически полностью подавляют активность ПАРП 1 во всех исследуемых группах (рис. 3).

ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС

Рисунок 3. Действие физиологических концентраций АТФ  на активность ПАРП 1 в ядрах клеток печени неполовозрелых (6 нед.) и половозрелых крыс (10 нед.).

Введение цисплатина 6-и нед. крысам не влияет на степень ингибирования ПАРП 1 АТФ. У 10-и нед. самцов цисплатин увеличивает эффективность ингибирования фермента 1мМ АТФ, нивелируя половые различия в ингибировании (рис. 4).

ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС

Рисунок 4. Действие физиологических концентраций АТФ  на активность ПАРП 1 в ядрах клеток печени неполовозрелых (6 нед.) и половозрелых (10 нед.) крыс после 48ч введения цисплатина (10мг/кг).

Методом вестерн блоттинга было показано, что резкая инактивация   ПАРП 1 после добавления АТФ в среду инкубирования ядер клеток печени крыс не обусловлена протеолитическим расщеплением фермента (рис. 5).

ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС

Рисунок 5. Идентификация ПАРП 1 в ядерных белках клеток печени крыс. а) ядра инкубировали в среде, не содержащей АТФ  б) ядра инкубировали в среде, содержащей 5мМ АТФ

Выводы:

  1. Активность ПАРП 1 в ядрах клеток печени крыс значительно уменьшается в процессе полового созревания.
  2. Введение цисплатина крысам исследованных возрастных групп вызывает разнонаправленное изменение активности ПАРП 1. У крыс пубертантного возраста (6 нед.) препарат заметно подавляет активность фермента, в то время как активность ПАРП 1 в ядрах печени 10-и нед. крыс увеличивается в 2,5 раза.
  3. Высокие физиологические концентрации АТФ (5мМ и 10мМ) полностью подавляют активность ПАРП 1 в ядрах клеток печени крыс. 1мМ АТФ подавляет активность ПАРП 1 в разной степени у 10-и недельных самок и самцов, проявляя половой диморфизм в ингибировании фермента.
  4. У 10-и недельных самцов цисплатин увеличивает эффективность ингибирования фермента 1мМ АТФ, нивелируя половые различия в ингибировании.
  5. Резкое подавление активности  ПАРП 1 в ядрах клеток печени крыс при воздействии высоких физиологических концентраций АТФ не обусловлено расщеплением фермента.

Список литературы:

  1. D’Amours D., Desnoyers S., D’Silva I. and Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. Biochem. J., 1999, 342: 249-268.
  2. Me´gnin-Chanet , M.A. Bollet ,J. Hall/Targeting poly(ADP-ribose) polymerase activity for cancer therapy/Cell. Mol. Life Sci., 2010, 67: 3649–3662.
  3. Hewish D.R., Burgoyne L.A. Chromatin Substructure, The Digestion of Chromatin DNA at Regularly Spaced  Sites  by a Nuclear Deoxyribonuclease. Biochemical and Biophysical Res. Com, 1973, 52: 504-510.
  4. Putta S. and  Hergenrother P.J. An enzymatic assay for poly(ADP — ribose)    polymerase – 1 (PARP-1) via the chemical quantitation of NAD+ : application to the high-throughput screening of small molecules as potential inhibitors. Analytical Biochemistry, 2004, 326: 78 – 86.
  5. Rouleau M., Aubin R., Poirier G. Poly(ADP-ribosyl)ated chromatin domains: access granted. Journal of Cell Science, 2004, 117(6), 815-825.
  6. Szabo C.., Pacher. P., . Swanson R. A. Novel modulators of poly(ADP-ribose) polymerase Trends Pharmacol Sci. 2006; 27(12): 626–630.
  7. Zhu G., Chang P., Lippard S.. Recognition of Platinum-DNA Damage by Poly(ADP-Ribose)Polymerase-1, J. Biochemistry , 2010; 49(29), p.6177-6183 .

«This work was made possible by a research grant from the Armenian National Science and Education Fund (ANSEF) based in New York, USA»[schema type=»book» name=»ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА АКТИВНОСТЬ ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС» description=»Опухолеобразование является сложным и многоэтапным процессом, чаще всего обусловленным бесконтрольным ростом той или иной клеточной популяции вследствие нарушения молекулярных процессов, контролирующих и регулирующих нормальное протекание клеточной пролиферации. Наряду с этим развитие злокачественных новообразований во многих случаях обусловлено нарушениями и неисправностями клеточных механизмов, ответственных за элиминацию перерожденных клеток. Мишенью многих препаратов, которые в настоящее время широко применяются в лечении злокачественных новообразований, является ядерная ДНК раковых клеток. Одним из наиболее эффективных химиотерапевтических ДНК-алкилирующих препаратов является цисплатин. Эффективность цисплатина связана с повреждением ДНК опухолевой клетки, в результате чего формируются цис-ДДП–ДНК–аддукты, блокирующие репликацию, транскрипцию и клеточную пролиферацию в целом [2, с. 3556]. Поли(АДФ-рибозо)полимераза 1 (ПАРП 1), будучи мощным эпигенетическим регулятором, играет ключевую роль в различных механизмах клеточной гибели [5, с. 822]. В ответ на повреждения ДНК ПАРП 1 активируется более чем в 500 раз [1, с. 250], тем самым способствуя успешной сборке репарационной системы в точках ДНК-разрывов, что в конечном итоге приводит к выживанию клеток [7, с. 6181]. Таким образом, инактивация ПАРП 1 увеличивает цитотоксическое действие цисплатина на опухолевые клетки. Данные клинических испытаний указывают на проявление половых различий в терапевтическом эффекте ингибиторов ПАРП 1 [6, с. 627]. Актуальной задачей современной медицины является исследование взаимодействия лекарств при сочетанном применении в сложных химиотерапевтических схемах лечения опухолей. Целью настоящей работы является сравнительное изучение действия терапевтических доз цисплатина на активность и ингибирование ПАРП 1 аллостерическим ингибитором АТФ в клетках печени крыс разного пола и возраста. » author=»Асатрян Ануш Левоновна » publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-02-02″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_26.09.15_10(18)» ebook=»yes» ]

Список литературы:


Записи созданы 9819

Похожие записи

Начните вводить, то что вы ищите выше и нажмите кнопку Enter для поиска. Нажмите кнопку ESC для отмены.

Вернуться наверх
jendralmaya Slot slot gacor 2023 slot demo slot demo slot deposit pulsa slot demo slot demo slot slot deposit pulsa slot data hk data sgp data sdy data macau https://sebatik.wicida.ac.id/public/slot-demo/ slot demo slot demo
404: Not Found