В настоящее время идет активный поиск решения проблем клеточной биологии. Найден путь индуцированной плюрипотентности клеток [5], появляются машины для наращивания биоматериала и конструирования 3D объектов, однако по-прежнему остается нерешенным вопрос, как инициировать самоорганизацию стволовых клеток in vitro. Моделью для изучения данных механизмов традиционно являются амфибии, так как они обладают наилучшей естественной регенерационной способностью среди всех позвоночных. Для исследователя всегда более ценен тот эксперимент, который является наиболее наглядным и наименее травматичным для испытуемого. Одним из таких примеров может стать восстановлени пигментных клеток у личинок шпорцевых лягушек, опыт, который был впервые осуществлен в нашей лаборатории.
В коже амфибий содержатся несколько видов клеток, берущих свое начало от популяции клеток нервного гребня: хромафинные, пигментные, глиальные, нервные клетки ПНС. Пигментные клетки, или конкретнее меланофоры, наиболее интересны тем, что они сочетают в себе свойства нервных клеток (например, антероградный и ретроградный везикулярный транспорт) и обычных эпителиальных (способны к митозу в дифференцированном состоянии). Несмотря на сложную организацию цитоскелета, приспособленную для миграции пигмента, меланофоры в зрелом состоянии при делении сохраняют карту перемещения пигментных гранул в дочерних клетках, что, в свою очередь, можно считать своеобразной клеточной памятью.
Меланофоры располагаются в дерме кожи и развиваются из меланобластов. Эти клетки амфибий не иннервированы, но имеют ярко выраженную чувствительность к специфическим гормонам меланоцитстимулирующему гормону (МСГ) и мелатонину. Под действием мелатонина, а также адреналина, происходит движение пигментных гранул (меланосом) в перикариальную область к центриоли (агрегация), а под действием МСГ, АКТГ, липотропина и др. – распределение по всей клетке (дисперсия). Благодаря пигменту, меланину, меланофоры видны в световой микроскоп. Увеличение численности пигментных клеток в процессе развития личинок шпорцевой лягушки происходит как за счет митозов, так и за счет дифференцировки новых клеток из бластных форм. Во время восстановления разрушенных клеток мы также можем наблюдать оба этих процесса и оценивать вклад каждого из них. В нашей работе мы рассматриваем восстановительные способности популяции пигментных клеток в покровах личинок шпорцевых лягушек. На процесс регенерации влияют две группы факторов, эндо- и экзогенной природы. Эндогенным стоит считать гормональный фон, уровень метаболизма, созревания тканей и органов, что можно объединить общей формулировкой – стадия развития. Внешним фактором является количество отраженного света.
Головастиков содержали при постоянных условиях в термостате ТСО-1/80 СПУ при температуре 23 С на постоянном освещении 40 люкс [3]. Все личинки были распределены на три группы по фонам (белый, нейтральный и темный). В качестве нейтрального фона использовался серый. Именно на сером фоне индекс дисперсии меланофоров равен трем, что является промежуточным значением. Каждая группа включала более трех контрольных и опытных животных. У головастиков из экспериментальной группы разрушали пигментные клетки (меланофоры) на участке от глаза до проекции правой дуги аорты. Операцию проводили с помощью механического воздействия стеклянным капилляром под бинокуляром ЛОМО МСП-1. Эксперимент длился 12 дней. На 2,5,7,9 и 12 день проводили видеофиксацию на камеру ToupCam. Анализ числа клеток вели с помощью программы ImageJ и Excel. При первом подсчете подбирался определенный участок с 30 клетками. В опытную и контрольную группы были включены головастики 46-48, 52-54 и 55-58 стадий [4]. Обработанные материалы представлены в виде процентных отношениях числа клеток в начале и в конце эксперимента и в виде графика.
Показано, что число пигментных клеток на анализируемом участке покровов личинок по истечении срока наблюдения больше в опытной группе, чем в контрольной. Обнаружено отличие характера регенерации на разных стадиях развития: с увеличением стадии, восполнение числа клеток все больше зависит от дифференцировки меланобластов, митозы встречаются все реже. После 57 стадии митозы отсутствуют, даже у личинок, содержащихся на темном фоне. Новообразованные пигментные клетки в коже опытных головастиков на момент окончания эксперимента меньше по размеру, чем интактные клетки как в опытной, так и в контрольной группе в 2-3 раза по диаметру. У личинок 55-58 стадий развития, содержащихся на белом фоне, наблюдалось значительное падение пролифератиной активности, так что в конце опыта общее число клеток в исследуемом регионе было на 30% меньше, чем до операции. Причем новообразованные клетки были меньше интактных и не закрывали всего пространства лишенного пигментации в ходе операции. Восстановление пролиферативной активности происходило на 66 стадии, т.е. после завершения метаморфозного климакса [1]. На ранних стадиях (46-48) число клеток у контрольных головастиков превышало, число клеток после регенерации у животных опытной группы. Для животных, содержащихся на темном фоне опытной группы этот показатель составил – 59%, на сером фоне — 34%, на белом – 17%. В то же время в контрольной группе мы наблюдали увеличение числа клеток на 74%, 71% и 44% соответственно. Для 52-53 стадии показано, что увеличение числа клеток в контрольной группе происходило на 14-21% с минимумом на белом фоне, а в опытной группе на 40-52% соответственно. На поздних стадиях увеличение числа клеток наблюдалось только на сером и черном фоне (56% и 54% соответственно), на белом фоне число клеток после операции было меньше, чем до нее. В контроле число клеток изменилось незначительно.
По всей видимости, потеря контактного ингибирования стимулирует клетки к митозу, а воспалительная реакция к дифференцировке меланобластов. Важную роль в регуляции пролиферации принимают хромаффинные клетки. Причем на интенсивность этих процессов оказывают влияние гормоны МСГ и мелатонин, концентрация которых в крови напрямую зависит от светового режима. Отмечено, что на черном фоне головастики наиболее интенсивно растут на стадиях от 48 до 54. Белый фон тормозит развитие личинок шпорцевой лягушки на ранних стадиях, нейтрален на стадии 52-54, и ускоряет развитие на поздних стадиях. Данный эксперимент подтверждает гипотезу о влиянии фона на пролиферативную активность недифференцированных клеток, а значит и на общее состояние личинок.
В условиях сложной биологической системы является достаточно трудоемким определить ключевой фактор, изменения которого приводит к оригинальному показателю признака. В нашем случае стандартизированные условия содержания личинок дают нам шанс интерпретировать результаты относительно корректно, а именно то, что действие избыточного количества мелатонина тормозит процесс дифференцировки и восстановления пигментации покровов [3]. Данная реакция обусловлена одновременно физиологическим и биохимическим свойством мелатонина. Этот гормон, специфически связываясь меланофорами, удерживает меланосомы, что мешает образованию веретена деления. А также мелатонин снижает уровень окислительного стресса и реакционность клетки, благодаря чему многие процессы в меланобласте замедляются, тем самым откладывая дифференцировку на более поздний срок.
Литература
- Виноградская И.С. Молчанов А.Ю. Структурно-функциональная перестройка кожи шпорцевой лягушки в период метаморфоза, XVI Ломоносовские чтения, стр. 7
- Захарова Л.А. Влияние световых условий на развитие меланиновой пигментации в онтогенезе амфибий : автореф. дис. … канд. биол.наук. М., 22 с. 3.
- Молчанов А.Ю., Точило У.А., Виноградская И.С., Супруненко Е.А., Бурлакова О.В., Голиченков В.А. Репаративные процессы в пигментной системе в период личиночного развития бесхвостых амфибий, Сложные системы, № 3 (12), с.47-62
- Nieuwkoop P.D., Faber J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin)// Amsterdam. P. 1-243
- Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells, 2007 Nature 448, 313-317[schema type=»book» name=»ЕСТЕСТВЕННОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДЕРМАЛЬНЫХ МЕЛАНОФОРОВ У ЛИЧИНОК ШПОРЦЕВЫХ ЛЯГУШЕК XENOPUS LAEVIS» author=»Точило Ульяна Алексеевна, Молчанов Александр Юрьевич, Великанов Александр Николаевич» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-05-19″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.01.2015_01(10)» ebook=»yes» ]