Введение
Поиск и выделение чистых культур дрожжей из природных источников издавно интересовало учёных-микробиологов. Монголы издавно применяют в своем рационе кисломолочные продукты, такие как кумыс, верблюжье молоко, кислое коровье молоко, из которого путем перегона получают спиртосодержаший напиток. Но в нашей стране мало уделяют внимания выделению чистых культур микроорганизмов из природных источников [1, с.3]. Выделенные местные штаммы культур могут быть использованы как закваски для производства различных кисломолочных продуктов. Целью данной работы является выделение и частичная идентификация дрожжей, сбраживающих лактозу. Объектом исследования были выбраны кумыс, верблюжье молоко, кислое коровье молоко. Данные молочные продукты доставлены из разных районов Монголии.
Результаты исследования
При посеве на картофельно-лактозном агаре [2, с.80-92] были получены выпуклые блестящие серовато-белые колонии с гладкой поверхностью. Колонии дрожжей, выделенные из кумыса, по размеру больше, чем колонии дрожжей, выделенные из коровьего и верблюжьего молока.
Клетки дрожжей крупные по размеру и разнообразны по форме. Штаммы Х12 и Х26 имеют прямоугольные клетки, а штамм Х1, Х3, выделенные из верблюжьего молока, имеют клетки в виде зерна, которые расположены по одиночке. Клетки штаммов, выделенных из кумыса, имеют мицелий.
Клетки выделенных дрожжей не способны образовывать споры, что соответствует неспорообразующим дрожжам рода Candida.
Для идентификации дрожжей главным биохимическим признаком является их способность сбраживать различные источники углеводов, органических кислот. Для определения данного признака мы использовали жидкую питательную среду, в которую добавляли углеводы по традиционной методике [1]. Результаты показаны в таблице 1.
Таблица 1
Сбраживание углеводов
| № штамма |
Углеводы |
Контроль | |||||||
| Глюкоза | Фруктоза | Мальтоза | Ксилоза | Раффиноза | Лактоза | Сахароза | Дульцит | ||
| Х1 | + | + | — | + | + | + | + | — | — |
| Х12 | ++ | + | — | + | + | + | + | — | — |
| Х3 | — | ++ | ++ | + | + | ++ | ++ | — | — |
| Х9 | ++ | + | — | + | + | + | + | — | — |
| Х17 | ++ | ++ | — | + | + | + | ++ | — | — |
| Х23 | + | + | — | + | + | + | + | — | — |
| Х26 | + | — | — | + | + | + | — | — | — |
Примечание: + — сбраживают, — -не сбраживают
Как видно из таблицы, все выделенные штаммы способны сбраживать глюкозу, фруктозу, ксилозу, раффинозу, лактозу, сахарозу. Дульцит не один из штаммов не способен сбраживать, мальтозу сбраживает только штамм Х3.
Все выделенные штаммы в молочной сыворотке образуют газ. Все способны сбраживать молочный сахар. К другим углеводам проявляют различную активность. Штаммы, выделенный из кумыса /штамм Х3/ и верблюжьего молока /штаммы Х17-Х23/, активно окисляет мальтозу, сахарозу, фруктозу. Штамм Х26, выделенный из коровьего молока, не окисляет сахарозу и фруктозу, штамм Х12 – мальтозу, остальные штаммы не сбраживают только мальтозу. Таким образом, дрожжи, выделенные из кумыса и верблюжьего молока, обладают более высокой окислительной активностью, чем дрожжи из коровьего молока. При изучении способности данных дрожжей сбраживать органические кислоты получены следующие результаты /таблица 2/.
Таблица 2
Сбраживание органических кислот
| Кислота | Х1 | Х12 | Х3 | Х9 | Х17 | Х23 | Х26 |
| Винная | — | — | — | — | + | — | — |
| Лимонная | + | + | + | + | + | + | + |
| Уксусная | + | + | + | + | + | + | + |
| Янтарная | + | + | + | + | + | + | + |
| Молочная | + | + | + | + | + | + | + |
Из таблицы 2 видно, что выделенные штаммы дрожжей, кроме штамма Х17, все не способны сбраживать винную кислоту. По данному признаку выделенные штаммы соответствуют дрожжам рода Candida.
По систематике дрожжей Кудрявцева В.И. [3, с.256] данные штаммы дрожжей относятся к следующему виду:
Семейство Saccharomycetaceae
Род Fabospora nov.gen.Kudriavzev
Вид Fabospora fragilis /Candida pseudotropicalis
По API 20 Candida системе были определены способность данных штаммов сбраживать углеводы /таблица 3/
Таблица 3
Идентификация по API Candida системе
| штамм |
Углеводы |
|||||||||||
|
GLU |
SAC | β
MAL |
TRE | PAF | GAL
|
α AMY | β
XYL |
β
GUR |
URE | β
NAG |
β GAL |
|
| Х-1 | + | + | — | + | + | + | — | — | — | — | — | — |
| Х-12 | + | + | — | + | — | + | — | + | — | — | — | — |
| Х-3 | + | — | — | — | — | — | — | — | — | + | — | — |
| Х-23 | + | + | — | + | — | — | — | — | — | — | — | + |
| Х-26 | + | + | — | + | — | + | — | + | — | — | — | + |
| А-1 | + | + | — | + | + | — | — | — | — | — | — | — |
| А-2 | + | + | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — |
| А-3 | + | + | — | + | + | — | — | — | — | — | — | — |
| КГ | + | + | — | + | + | — | — | + | — | — | — | — |
Таблица 4
Идентификация по API системе
|
Штамм |
Номер серии | Вид |
Принадлежность |
| А-3 | 7300 | Saccharomyces cerevisiae | 98.8% |
| А-1 | 7300 | Saccharomyces cerevisiae | 98.8% |
| Х-1 | 7300 | Saccharomyces cerevisiae | 98.8% |
| КГ | 7723 | Candida guilliermondii | 85% |
| Х-12 | 7320 | Candida guilliermondii | 96.8% |
| Х-3 | 7244 | Candida kefyr | 98% |
| Х-23 | 1001 | Candida krusei | 83.1% |
| Х-26 | 7120 | Candida lusitaniae | 73.5% |
Концентрация ДНХ выделенных дрожжей определена с помощью Nano Drop. Спектр поглощения находился в пределах 45,7-282,3нм. Из банды, выделенной на праймере М13, видно, что штаммы Х12 и Х26 имеют ДНХ другого размера, чем ДНХ других штаммов дрожжей.
Рисунок 1. Результаты гель агароз-электрофореза и RAPD-PCR
Выводы:
- Из традиционных кисломолочных продуктов Монголии нами выделены штаммы дрожжей, способные сбраживать лактозу.
- По традиционными микробиологическими методами определены морфологические, физиолого-биохимические признаки данных дрожжей. По этим признакам данные штаммы отнесены к роду
- При идентификации дрожжей с помощью API 20 Candida системе и изучении ДНХ данных дрожжей с помощью цепной полимеразной реакции данные штаммы дрожжей относятся к различным видам. Из выделенных штаммов к виду Saccharomyces cerevisiae относятся штаммы Х1, А1, А3 /98,8%/, к виду Candida guilliermondii принадлежность составляет 96,8%, к виду Candida kefyr – 98% соответственно.
- В дальнейшем наши исследования будут направлены на определение видовой принадлежности выделенных местных штаммов дрожжей на основе нуклеотидной последовательности.
Список литературы:
- С.Дэлгэрмаа, Ц.Энхтуул Методы идентификации дрожжей и молочнокислых бактерий. – Улаанбаатар, 2012, с.3
- Квасников Е.И., Шелокова И.В. Дрожжи. – Киев, изд-во Науково Думка, 1991, 80-92 с.
- Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. – изд-во АН СССР, М., 1954, с.256[schema type=»book» name=»ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ДРОЖЖЕЙ, СБРАЖИВАЮЩИХ ЛАКТОЗУ» description=»Целью исследования было выделение лактозосбраживающих дрожжей из ферментированного верблюжьего молока (хормог), кумыса, собранных из разных регионов Монголии. Было выделено тридцать три штамма, из которых были отобраны пять штаммов, идентифицированные в ходе данного исследования. Чистые культуры этих штаммов были выделены на агаризованных средах, изучены их физиолого-биохимические признаки по традиционными микробиологическими методами. Физиологические и биохимические свойства дрожжей были определены на 16 тестах ассимиляции и использования углеводов и другими способами. В настоящей работе RAPD-PCR с праймерами M13 и RF2 /Андригетто, 1999/ и API Candida системами были применены на штаммах дрожжей, выделенных из кисломолочных продуктов Монголии. Результат исследования показывает, что большинство штаммов дрожжей имеют клетки в форме эллипса; однако два штамма имели шарообразные клетки. В то же время штаммы дрожжей X12, X26 образуют псевдо-мицелии. Клетки штаммов дрожжей, выделенных из ферментированного верблюжьего молока, обладали различными формами. Большинства из выделенных штаммов дрожжей использовали сахарозу, лактозу, D-глюкозу, молочную кислоту, сукцинат, цитрат и ледяную уксусную кислоту. Штаммы X1, X9, X17, X23 обладала уреазной активностью. Штаммы X1, X9, X12, X3 гидролизуют крахмал. Все штаммы показали способность к росту при 20-27oC [1, с.18-20]. В результате применения системы API Candida была определена родовая принадлежность 5 штаммов дрожжей. Системой API Candida идентифицировано 73.5% — 98.8% изолятов. Это означает, что четыре из пяти штаммов были четко отнесены к роду Candida и один отнесен к роду Saccharomyces. RAPD-ЦПР штаммов разных видов дрожжей дала различные профили, которые позволили сделать четкое определение всех видов.» author=»Амарбаясгалан Оюун-Эрдэнэ, Совд Дэлгэрмаа, Ц.Энхтуул» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-01-09″ edition=»euroasia-science.ru_29-30.12.2015_12(21)» ebook=»yes» ]