Для получения гидролизатов сывороточных белков ферментными препаратами необходимо подобрать наиболее эффективные параметры данного технологического процесса, которые бы обеспечивали ферментативный гидролиз полипептидной цепи с образованием низкомолекулярных пептидов. При этом для гидролиза сывороточных белков целесообразно использование ферментных препаратов, характеризующихся эндопептидазной активностью. Это дает возможность проводить процесс гидролиза в более щадящих условиях по сравнению с использованием химических агентов [5, с. 47].
Кислотный гидролиз характеризуется рядом недостатков: во-первых, при кислотном гидролизе наблюдается полное разложение триптофана и многих других аминокислот, во-вторых образующийся при этом гидролизат приобретает темную окраску, в-третьих возникает проблема удаления кислоты и ее солей из получаемого гидролизата. Щелочной гидролиз способствует потере биологической ценности гидролизата в результате рацемизации аминокислот. Ферментативный гидролиз практически полностью исключает повреждение аминокислот и утрату биологической ценности образуемого продукта [2, с. 47].
Известно, что все ферментные препараты характеризуются удельной активностью, а также оптимальным диапазоном pH и температуры, при котором они проявляют наибольшую активность [3, с. 391]. Для проведения исследований были выбраны три ферментных препарата, обладающих эндопептидазной активностью. Результаты анализа данных ферментов представлены в табл. 1.
Таблица 1 — Характеристика используемых ферментных препаратов
|
Название фермента |
Вид фермента | Оптимальный рН | Молекулярная масса, Да |
Удельная активность, |
| Термолизин | Эндопептидаза | 6,5-8,5 | 34 600 | 40 |
| Пепсин | 5,0-6,5 | 35 000 | 26 | |
| Бромелайн | 4,5-9,0 | 28 000 | 65 |
Из вышеуказанных данных можно сделать вывод о том, что наибольшей удельной активностью в 65 усл. ед / мг обладает бромелайн, а наименьшей (26 усл. ед / мг) – пепсин. Бромелайн характеризуется также наибольшим диапазоном действия pH из всех выбранных ферментов – от 4,5 до 9,0. Термолизин и пепсин обладают схожими значениями молекулярных масс, в то время как молекулярная масса бромелайна на 20% ниже, что стоит учитывать при проведении гидролиза. Стоит отметить, что в общем случае по сравнению с экзопептидазами эндопептидазы характеризуются более широким спектром pH, при котором они проявляют наибольшую протеолитическую активность [4, с. 515].
Вначале исследовали влияние ферментных препаратов на процесс гидролиза пептидных связей молекул сывороточных белков. Ферментативный гидролиз проводили при уровне pH 6,5, оптимальной температуре для данных ферментов 35°С в течение 8±0,05 ч, при фермент-субстратном соотношении 1:100. Результаты исследований степени гидролиза отражены в табл. 2.
Таблица 2 – Степень гидролиза сывороточных белков
|
Степень гидролиза, % |
||
| Термолизин | Пепсин | Бромелайн |
| 33,45±1,6 | 31,68±1,5 | 34,59±1,7 |
Данные исследований свидетельствуют о том, что степень ферментативного гидролиза не превышает 35 %, что вполне согласуется с литературными данными. Наибольшая степень гидролиза (34,59 %) наблюдается у бромелайна, что на 3,4 % выше, чем у термолизина и на 9,2 % больше, чем у пепсина.
Анализ фракционного состава сывороточных белков различными ферментами представлен в табл. 3.
Таблица 3 – Фракционный состав сывороточных белков до и после ферментативного гидролиза
|
Массовая доля азота во фракциях, % |
Состояние белка |
|||
| До гидролиза | После гидролиза термолизином | После гидролиза пепсином |
После гидролиза бромелайном |
|
| общее содержание | 14,04±0,7 | 4,96±0,25 | 4,34±0,21 | 5,23±0,26 |
| β-лактоглобулин | 5,84±0,29 | 2,44±0,12 | 2,22±0,11 | 2,46±0,12 |
| α-лактальбумин | 2,67±0,13 | 1,05±0,05 | 0,82±0,04 | 1,34±0,07 |
| сывороточный альбумин | 0,90±0,05 | 0,30±0,02 | 0,29±0,01 | 0,34±0,02 |
| иммуноглобулины | 2,10±0,11 | 0,63±0,03 | 0,55±0,03 | 0,58±0,03 |
| протеозо-пептоны | 2,53±0,13 | 0,54±0,03 | 0,46±0,02 | 0,51±0,03 |
В процессе ферментативного гидролиза сывороточных белков термолизином массовая доля β-лактоглобулина и α-лактальбумина сократилась соответственно в 2,2 и 2,5 раза, а массовая доля сывороточного альбумина и иммуноглобулинов — в 3 и 3,3 раза соответственно. Наибольшему изменению подверглись протеозо-пептоны – в процессе гидролиза термолизином они сократились в 4,7 раза.
При гидролизе пепсином наблюдаются схожие значения изменений фракций белков: остаточное количество β-лактоглобулина и α-лактальбумина составило 38 % и 30 %, для сывороточного альбумина, иммуноглобулинов и протеозо-пептонов эти значения равны соответственно 32 %, 26 % и 18 %. В случае гидролиза сывороточных белков бромелайном остаточное количество вышеуказанных фракций составило 42 %, 50 %, 38 %, 28% и 20 %.
Для более глубокого анализа процессов, протекающих при ферментативном гидролизе, были проведены исследования молекулярно-массового распределения белковых фракций, образующихся под действием протеолитических ферментов. Гидролиз проводили при активной кислотности pH 6,5, температуре 35°С в течение 8±0,05 ч, при фермент-субстратном соотношении 1:100. В качестве контрольного образца выбрали сывороточный белок, не подвергшийся ферментативному гидролизу, с молекулярной массой 35 кДа. Молекулярно-массовое распределение получали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле методом Леммли. Результаты отражены в табл. 4.
Таблица 4 — Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов в результате ферментативного гидролиза
|
Молекулярная масса, кДа |
Массовая доля фракций, % | ||
| Термолизин | Пепсин |
Бромелайн |
|
| Более 30 | 1,77±0,08 | 2,46±0,12 | 1,21±0,06 |
| 20-30 | 3,26±0,16 | 3,99±0,19 | 3,45±0,17 |
| 20–10 | 19,97±0,99 | 18,38±0,92 | 21,69±1,08 |
| 10–5 | 31,12±1,55 | 35,05±1,75 | 29,15±1,45 |
| Менее 5 | 43,88±2,19 | 40,12±2,01 | 44,50±2,22 |
Анализ представленных результатов позволяет сделать вывод о том, что в ходе ферментативного гидролиза сывороточных белков происходит перераспределение фракций, при этом соотношение отдельных фракций зависит от вида используемого ферментного препарата. При гидролизе в течение 10 ч массовая доля фракций с молекулярным весом более 30 кДа заметно сокращается и составляет 1,77 % при использовании термолизина, 2,46 % — при использовании пепсина и 1,21 % при использовании бромелайна. Большая часть фракций приходится на белки с низкой молекулярной массой – менее 10 кДа.
Для анализа биологической ценности полученных гидролизатов был проведен анализ аминокислотного состава до и после проведения ферментативного гидролиза [1, с. 167]. Результаты данного анализа отражены в табл. 5
Таблица 5 – Динамика накопления свободных аминокислот в результате гидролиза сывороточных белков, %
|
Аминокислоты |
Исходный образец белка (связанные) | Термолизин (свободные) | Пепсин (свободные) |
Бромелайн (свободные) |
|
Незаменимые аминокислоты |
||||
| Валин | 6,63±0,33 | 2,22±0,11 | 2,10±0,11 | 2,29±0,11 |
| Изолейцин | 5,21±0,26 | 1,74±0,09 | 1,65±0,08 | 1,80±0,09 |
| Лейцин | 9,14±0,46 | 3,06±0,15 | 2,90±0,14 | 3,16±0,16 |
| Лизин | 6,5±0,33 | 2,17±0,11 | 2,06±0,10 | 2,25±0,11 |
| Метионин | 2,59±0,13 | 0,87±0,04 | 0,82±0,04 | 0,90±0,04 |
| Треонин | 4,05±0,20 | 1,35±0,07 | 1,28±0,06 | 1,40±0,07 |
| Триптофан | 1,32±0,07 | 0,44±0,02 | 0,42±0,02 | 0,46±0,02 |
| Фенилаланин | 4,58±0,23 | 1,53±0,08 | 1,45±0,07 | 1,58±0,08 |
|
Заменимые аминокислоты |
||||
| Аланин | 2,78±0,14 | 0,93±0,05 | 0,88±0,04 | 0,96±0,05 |
| Аргинин | 4,09±0,20 | 1,37±0,07 | 1,30±0,06 | 1,41±0,07 |
| Аспарагиновая кислота | 6,47±0,32 | 2,16±0,11 | 2,05±0,10 | 2,24±0,11 |
| Гистидин | 2,22±0,11 | 0,74±0,04 | 0,70±0,04 | 0,77±0,04 |
| Глицин | 2,69±0,13 | 0,90±0,04 | 0,85±0,04 | 0,93±0,05 |
| Глутаминовая кислота | 19,18±0,96 | 6,42±0,32 | 6,08±0,30 | 6,63±0,33 |
| Пролин | 9,45±0,47 | 3,16±0,16 | 2,99±0,15 | 3,27±0,16 |
| Серин | 6,81±0,34 | 2,28±0,11 | 2,16±0,11 | 2,36±0,12 |
| Тирозин | 5,86±0,29 | 1,96±0,10 | 1,86±0,09 | 2,03±0,10 |
| Цистеин | 0,43±0,02 | 0,14±0,01 | 0,14±0,01 | 0,15±0,01 |
| Всего | 100±5,0 | 33,45±1,67 | 31,68±1,58 | 34,59±1,73 |
По данным, представленным в табл. 5 следует, что наибольшее накопление для всех аминокислот наблюдается при ферментативном гидролизе бромелайном, который характеризовался наибольшей протеолитической активностью в 65 усл. ед / мг. Максимальное накопление при обработке данным ферментом наблюдается у таких аминокислот как аргинин и тирозин.
Таким образом, обобщая результаты экспериментов можно сделать вывод о том, что из всех исследованных ферментов наибольшая эффективность гидролиза сывороточных белков наблюдается при использовании бромелайна. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовался именно этот ферментный препарат.
Список литературы:
- Влияние фракционного состава и степени гидролиза на биологическую ценность и усвояемость молочных белков / А.М. Сафронова, А.С. Витолло, В.И. Круглик и др. // Актуальные проблемы переработки молока и производства молочных продуктов: тезисы докладов Всесоюзного научно-технического симпозиума. – Вологда, 1989. – С. 167–168.
- Гмошинский, И.В. Получение и перспективы использования ферментативных гидролизатов сывороточного белка молока / И.В. Гмошинский, С.Н. Зорин, В.И. Круглик и др. // Питание здорового и больного человека: материалы конференции. – СПб., 2006. – С. 47–49.
- Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат, 1987. – 391 с.
- Диксон, М. Ферменты. В 3 т. / М. Диксон, Э. Уэбб; пер. с англ. – М.: Мир, 1982. – Т. 2. – 515 с.
- Зорин, С.Н. Получение ферментативного гидролизата белков молочной сыворотки, модифицированного по аминокислотному составу / С.Н. Зорин, В.И. Круглик // Питание здорового и больного человека: материалы конференции. – СПб., 2006. – С. 47–49.[schema type=»book» name=»ВЫБОР ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ГИДРОЛИЗА СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ» author=»Бондарчук Ольга Николаевна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-06-14″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)» ebook=»yes» ]