Нефть и нефтепродукты являются одними из основных загрязнителей окружающей среды и в первую очередь почвы [2]. В связи с этим разработка способов очистки нефтезагрязненных почв – одна из важнейших задач при решении проблемы антропогенного воздействия на окружающую среду [1]. Микробиологическая ремедиация (биорекультивация) является наиболее экономически выгодной и экологически безопасной по сравнению с остальными способами рекультивации (выжигание, взрывной способ, засыпка чистым грунтом) [3]. Под биорекультивацией подразумевается активизация аборигенной почвенной микрофлоры, сформировавшейся в условиях нефтяного разлива, а также внесение специально разработанных биопрепаратов. Разложение нефти и нефтепродуктов в почве в естественных условиях – процесс биохимический. Интенсивность деградации нефти находится в прямой зависимости от биологической (ферментативной) активности почвы, общего количества почвенной микрофлоры и ее физиологической активности. Внутри почвенного профиля главная роль в окислении нефти и нефтепродуктов принадлежит биологическому окислению, которое осуществляется в результате ферментативных реакций. Ферменты почвенных микроорганизмов участвуют в сохранении биохимического равновесия в почве при ее различных загрязнениях. Поэтому для определения изменения биологической активности почвы в процессе биоремедиации часто используют показатели пероксидазной (ПО) и полифенолоксидазной (ПФО) активности. Низкие дозы загрязнения углеводородами активизируют эти ферменты, средние и высокие дозы оказывают ингибирующее действие. Увеличение активности ПО объясняется включением фермента в процесс детоксикации, а ПФО – трансформацией продуктов нефтяного разложения в компоненты гумуса.
Исследования по изучению ферментативных свойств нефтезагрязнгенной почвы мы проводили в условиях микрополевого опыта с использованием нового консорциума микроорганизмов-нефтедеструкторов, в состав которго входили штаммы Acinetobacter calcoaceticus B-3780, A. radioresistens B-2838 и В-5064 [4].
В микрополевом масштабе ремедиация осуществлялась на специально оборудованной площадке в естественных условиях. Эксперимент проводили при 13-30 ºС, регулярной агротехнической обработке: рыхление один раз в неделю и увлажнение почвы.
Схема микрополевого опыта:
- Незагрязненная почва (контроль);
- Загрязненная отработанным маслом почва (без бактерий);
- Загрязненная отработанным маслом почва + бактерии;
- Загрязненная отработанным маслом почва + опилки;
- Загрязненная отработанным маслом почва + опилки + бактерии.
В данном опыте почву однократно загрязняли отработанным машинным маслом в дозе 10 г/кг почвы в слое 0-20 см. Общая площадь делянки (1×4) м, учетная – (1×0,8) м. Бактериальную культуру вносили дважды в начале эксперимента и спустя четыре недели. Раз в неделю производился отбор образцов и выполнены в двукратной повторности следующие виды анализов: содержание нефтепродуктов методом ИК-спектрометрии; количественный учет клеток; анализ ферментативной активности почвы.
Активность полифенолоксидазы определяли по образованию пурпурогаллина из пирогаллола. В качестве стандарта использовали раствор бихромата калия. 0,75 г K2Cr2O7 растворяли в 1 дм3 0,5 M HCl (оптическая плотность этого раствора соответствует таковой раствора, содержащего 0,1 мг пурпурогаллина в 1 мл). Для измерения активности полифенолоксидазы 5 г образца почвы помещали в 100 мл воды и добавляли 5 капель толуола, 20 минут вращали на шейкере, после чего фильтровали через фильтр «синяя лента». Для измерения к 10 мл фильтрата добавляли 5 мл 1 % пирогаллола и инкубировали 24 часа. Измеряли на спектрофотометре при λ=430 нм и толщине кюветы 1 см. Для измерения активности пероксидазы помимо пирогаллола добавляли 1 мл 0,5 % Н2О2. Активность пероксидазы выражали в миллиграммах пурпурогаллина на 1 г почвы за 24 часа [5].
В первые 15 дней наблюдалось увеличение активности пероксидазы и полифенолоксидазы, а в последующие дни активность пероксидазы начала стабилизироваться, а активность полифенолоксидазы стала снижаться (табл.1).
Таблица 1
Динамика пероксидазной и полифенолоксидазной активности в процессе ремедиации в микрополевом эксперименте
|
Участки |
Ферменты |
Активность (мг пурпургаллина /г почвы за 24 часа) |
|||
|
Время (сут.) |
|||||
| 7 | 14 | 21 | 35 | ||
| Почва | ПО | 0,75 | 0,99 | 1,05 | 0,99 |
| ПФО | 0,81 | 1,26 | 1,05 | 0,63 | |
| Падение коэффициента гумификации, % | — | 0 | 7 | 42 | |
| Масло | ПО | 0,27 | 0,9 | 1,2 | 1,26 |
| ПФО | 0,51 | 1,11 | 1,08 | 0,63 | |
| Падение коэффициента гумификации, % | — | 35 | 52 | 74 | |
| Почва+масло+
бактерии |
ПО | 0,3 | 1,11 | 1,05 | 1,2 |
| ПФО | 0,39 | 1,08 | 1,05 | 0,75 | |
| Падение коэффициента гумификации, % | — | 25 | 27 | 55 | |
| Почва+масло+
опилки |
ПО | 0,24 | 0,66 | 0,72 | 1,41 |
| ПФО | 0,51 | 0,78 | 0,87 | 0,63 | |
| Падение коэффициента гумификации, % | — | 44 | 43 | 79 | |
| Почва+масло+
опилки+бактерии |
ПО | 0,63 | 0,78 | 1,08 | 0,75 |
| ПФО | 0,42 | 0,93 | 0,99 | 0,6 | |
| Падение коэффициента гумификации, % | — | 0 | 0 | 0 | |
Примечание: при расчете падения коэффициента гумификации за 100 % брали коэффициент гумификации через 7 дней опыта.
Коэффициент гумификации – это величина выражающая отношение активности ПФО к активности ПО и позволяющая судить о преобладании катализируемых процессов. В системе «почва+отработанное масло» и «почва+масло+опилки» наблюдалось резкое уменьшение коэффициента гумификации, что свидетельствует о преобладании процесса окисления гумусовых веществ над процессом гумификации почвы и о снижении качества почвы в связи с ее загрязнением. В системе «почва+масло+бактерии» падение коэффициента гумификации замедлялось после внесения живой культуры углеводородразлагающих бактерий, но по мере отмирания клеток падение коэффициента гумификации возобновлялось в связи с присутствием в почве остаточных нефтепродуктов, тогда как в системе «почва+масло+опилки +бактерии» за 35 суток нам не удалось обнаружить падение коэффициента гумификации.
Таким образом, нами было показано, что после интродукции в нефтезагрязненную почву живой культуры исследуемого консорциума наблюдается уменьшение снижения коэффициента гумификации на 20 %, что свидетельствует о положительной направленности гумусообразования, способствующего повышению плодородия почвы. Таким образом, применение консорциума трех исследуемых штаммов в составе биопрепарата позволит повысить эффективность процесса биоремедиации нефтезагрязненных почв.
- Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах: Автореф. дис. докт. биол. наук: 03.02.01 / СПб., 1996. – 25 с.
- Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде/ Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. – 1996. – Т. 32, № 6. – С. 579-585.
- Оборин А.А. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таёжной зоны / А.А. Оборин, И.Г. Калачникова, Т.А. Масливец и др. // Восст. нефтезаг. почв. экос. – М.: Наука. – 1988. – С. 140-159.
- Перспективы использования штаммовВ-3780, В-2838, В-5064 бактерий родаAcinetobacter для деградации почвенных нефтяных загрязнений / Т.Т. Данг, О.О. Логинова, Е.В. Белоусова и др. // Проблемы региональной экологии. — 2011. -№ 4. — С. 202-208.
- Хазиев Ф. Х. Методы почвенной энзимологии. – М.: Наука, 2005. − 252 с.[schema type=»book» name=»ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ В ПРОЦЕССЕ БИОРЕМЕДИАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА ACINETOBACTER » description=»В ходе работы показано, что после интродукции в нефтезагрязненную почву живой культуры консорциума бактерий, состоящего из Acinetobacter calcoaceticus B-3780, A. radioresistens B-2838 и В-5064, наблюдается уменьшение снижения коэффициента гумификации на 20 %, что свидетельствует о положительной направленности гумусообразования, способствующего повышению плодородия почвы.» author=»Белоусова Елена Васильевна, Грабович Маргарита Юрьевна, Данг Тху Тхюи» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-03-14″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.05.2015_05(14)» ebook=»yes» ]