ПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ НОВЫХ СТРУКТУРНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАРНОЗИНА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПАРКИНСОНИЗМА

Болезнь Паркинсона (БП) – хроническое прогрессирующее нейродегенеративное двигательное расстройство, характеризующееся глубокой и избирательной утратой дофаминергических нейронов. БП относится к социально значимым заболеваниям. Это объясняется ее широким распространением и значительными финансовыми затратами на лечение и реабилитацию больных [2, 3] Несмотря на десятилетия исследований, БП остается неизлечимым заболеванием. Применяемые в настоящее время лекарственные препараты обеспечивают только симптоматическое облегчение, но не останавливают гибель дофаминергических нейронов и прогрессирование болезни [4].

Причины гибели нейронов при БП по-видимому многофакторны. Тем не менее, одним из ключевых молекулярных механизмов является хронический окислительный стресс (ОС) [9]. Природными протекторами клеток и тканей от окислительного стресса являются антиоксиданты. Однако в настоящее время спектр препаратов антиоксидантного действия с доказанной эффективностью, применяемых в комплексном лечении заболеваний ЦНС, ограничен.  В связи с этим, актуальной задачей является разработка новых лекарственных препаратов антиоксидантного ряда, обладающих нейропротекторным действием. Одним из перспективных природных антиоксидантов является карнозин (β-аланил-L-гистидина). Он обладает нейропротекторным действием и защищает нейроны от ОС в условиях in vitro и in vivo [1].

На экспериментальной модели паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone), характеризующихся высоким стационарным уровнем свободных радикалов в тканях, установлено, что последствия введения N-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР), вызывающего развитие острого паркинсонического симптомокомплекса, сопровождающегося развитием ОС в мозге, предотвращаются курсовым введением карнозина. Карнозин препятствует угнетению двигательной активности животных и развитию мышечной ригидности, а также позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной системы мозга, защищать белки и липиды от окислительной модификации [7].

Для достижения стабильного протекторного эффекта требуется введение избыточных доз карнозина, чтобы компенсировать его гидролиз под действием специфических дипептидаз – тканевой и сывороточной карнозиназ. В целях повышения эффективности карнозина были созданы его новые производные – S-тролокс-карнозин (S-TK), полученный путем конденсации с водорастворимым аналогом витамина Е – тролоксом и содержащие карнозин нанолипосомы (КСЛ).

S-TK обладает основными биологическими свойствами карнозина, но при этом характеризуется более высокой устойчивостью к карнозиназе [10] и более высокой антиоксидантной активностью по сравнению с тролоксом и карнозином, определяемой по хемилюминесцентному тесту [6]. Кроме того, по сравнению с тролоксом и карнозином, S-TK эффективнее защищает клетки от ОС, вызванного тяжелыми металлами [5].

Выявлена способность КСЛ подавлять рост АФК и снижать гибель нейрональных клеток, повышая их жизнеспособность при индукции ОС пероксидом водорода, спермином, акролеином или кадмием [5].

Целью работы стало изучение защитного действия новых комплексов карнозина на экспериментальной модели БП in vitro в условиях окислительного стресса.

На клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y, дифференцированной по дофаминергическому пути, болезнь Паркинсона моделировали путем добавления нейротоксина 6-гидроксидофамина (6-OHDA).

Защитное действие комплексов карнозина на выживаемость клеток определяли по МТТ-тесту, основанному на восстановлении живыми клетками желтого 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ) в синие кристаллы формазана [8]. Измеряли оптическую плотность образовавшегося раствора формазана в ДМСО при длине волны 570 нм (и длине волны сравнения 660 нм) на планшетном флуориметре Synergy H4 (BioTek).

При 24 ч инкубации клеток с S-TK (в пределе концентраций от 0,1 до 1 mM) было выявлено повышение их жизнеспособности в присутствии наиболее высокой 1 mM концентрации тролокс-карнозина до 120%. Было показано, что в присутствии 50 μM 6-OHDA при 24 ч инкубации выживаемость клеток снижается на 40%. Внесение в культуральную среду STK во всех изученных концентрациях (0,1; 0,25; 0,5; 0,75 и 1 mM) повышало жизнеспособность клеток (до 73 — 79% — 86% — 96% — 101% соответственно. При этом в концентрации 1 mM она достигает уровня интактных клеток (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние S-тролокс-карнозина в концентрациях от 0,1 до 1 mM на жизнеспособность клеток нейробластомы человека при 24 ч инкубации с 50 μM 6-OHDA (M±m).

Примечание: *-р<0,05 при сравнении с интактными клетками; ^#-p<0,05 при сравнении с клеткам, инкубированным с 6-OHDA (Манн-Уитни U тест).

Уровень АФК в клеточной популяции определяли на проточном цитометре с помощью флуоресцентного красителя 2’,7’-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (DCFН2-DA), интенсивность флуоресценции которого соответствует уровню АФК. Долю мертвых клеток также определяли методом проточной цитометрии, используя окрашивание клеток иодидом пропидия (PI). За 3 минуты до измерения добавляли 10 μМ PI, который является меткой клеток с поврежденной мембраной, то есть некротических.

При 24 ч инкубации клеток с 150 μM 6-OHDA, КСЛ в концентрации 1 mM, снижают уровень АФК до нормы (рис. 2Б), что сопровождается уменьшением доли мертвых клеток на 24% (рис. 2А). Не нагруженные карнозином липосомы не влияют на уровень АФК и смертность клеток.

Рисунок 2. Влияние карнозина, пустых и карнозин-содержащих нанолипосом в концентрации 1 mM на гибель клеток (А) и уровень АФК (Б) в условиях интоксикации 50 μM 6-OHDA в течение 24 ч (M±m).

Примечание: *-р<0,05 при сравнении с интактными клетками; ^#-p<0,05 при сравнении с клеткам, инкубированным с 6-OHDA (Манн-Уитни U тест).

Исследования, проведенные с помощью флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени, путем добавления флуоресцентного красителя DCFН2-DA, выявили способность комплексов на основе карнозина препятствовать росту АФК в первые 20 минут после добавления нейротоксина (рис. 3 и 4).

Таким образом, показана способность новых структурных комплексов на основе карнозина повышать выживаемость и снижать гибель клеток, а также снижать уровень АФК в условиях нейротоксичности 6-OHDA, что свидетельствует об их высокой антиоксидантной активности. Полученные результаты послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и специфичных препаратов на основе новых комплексов природного антиоксиданта карнозина.

Данное научное исследование проводится при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «УМНИК» по теме «Использование наноструктурных комплексов карнозина при болезни Паркинсона» в рамках договора № 7160ГУ2/2015 от 03.08.2015.

Список литературы:

1. Болдырев А.А. Карнозин: новые концепции для функций давно известной молекулы // Биохимия. – 2012. – Т. – № 4. – С. 403-418
2. Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. – М.: Янус-К, 2003. – 248 с.
3. Крыжановский Г.Н., Карабань И.Н., Магаева С.В., Кучеряну В.Г., Карабань Н. В. Болезнь Паркинсона (этиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика). – М.: Медицина, 2002. – 336 с.
4. Левин О.С., Федорова Н.В. Болезнь Паркинсона /под ред. Левина О.С., Федоровой Н.В. – 3-е изд. – М.: МЕДпресс-информ, 2012. – 352 с.
5. Федорова Т.Н., Куликова О. И., Стволинский С. Л., Орлова   В. С. Протекторное действие (S)-тролокс-карнозина на культуру клеток нейробластомы человека SH-SY5Y в условиях токсичности тяжелых металлов // Нейрохимия. – 2016. – Т. 33. –  № 1. – С. 63-69
6. Федорова Т.Н., Стволинский С.Л., Куликова О.И., Коновалова Е.В., Левачева И.С., Самсонова О., БаковскийУ. Эффективность нейропротекторного действия новых производных природного антиоксиданта карнозина в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo // Анн. клинич. и эксперим. неврол. – 2016. – Т. 10. –  № 1. –  С. 47-52.
7. Сорокина Е. В., Бастрикова Н.А., Стволинский С.Л., Федорова Т.Н. Эффекты карнозина и селегилина при паркинсонизме, вызванном введением МРТР // Нейрохимия. – 2003. –  Т. 20. –  № 2. –  С. 133-138.
8. Gunz F.W. Reduction of tetrazolium salts by some biological agents // Nature. – 1948. – № 162. – 98.
9. Forno L.S. Neuropathology of Parkinson’s disease // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1996. – 55. – P. 259-272
10. Stvolinsky S.L., Bulygina E.R., Fedorova T.N., Meguro K., Sato T., Tyulina O.V., Abe H., Boldyrev A.A. Biological Activity of Novel Synthetic Derivatives of Carnosine //   Mol. Neurobiol. – 2010. – № 3. – 395-404[schema type=»book» name=»ПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ НОВЫХ СТРУКТУРНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАРНОЗИНА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПАРКИНСОНИЗМА» description=»Изучено протекторное действие новых комплексов карнозина: S-тролокс-карнозина и карнозина, включенного в состав нанолипосом на клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y, дифференцированной по дофаминергическому типу, в условиях окислительного стресса, индуцированного 6-гидроксидофамином (экспериментальная модель болезни Паркинсона in vitro). Выявлена способность новых структурных комплексов на основе карнозина повышать выживаемость и снижать гибель клеток, а также снижать уровень АФК в данных экспериментальных условиях, что свидетельствует об их высокой антиоксидантной активности. Полученные результаты послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и специфичных препаратов на основе новых комплексов природного антиоксиданта карнозина. » author=»Куликова Ольга Игоревна, Федорова Татьяна Николаевна, Стволинский Сергей Львович, Орлова Валентина Сергеевна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2016-12-18″ edition=»euroasia-science_28.04.2016_4(25)» ebook=»yes» ]