СПІВВІДНОШЕННЯ ПРОЦЕСІВ СИНТЕЗУ ТА АПОПТОЗУ В НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПА ЩУРІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ЦУКРОВИМ ДІАБЕТОМ, УСКЛАДНЕНИМ ГОСТРИМ ПОРУШЕННЯМ КРОВООБІГУ В БАСЕЙНІ СОННИХ АРТЕРІЙ

Оскільки цукровий діабет (ЦД) – визнаний чинник ризику виникнення інсультів [4, 5], дослідження фундаментальних механізмів даного явища є предметом уваги як патофізіологів, так і клініцистів. Незважаючи на значну поширеність такої поєднаної патології на сьогоднішній день кількість досліджень її патогенезу обмежена, що мотивує актуальність робіт даного спрямування.

Мета роботи – вивчити динаміку співвідношення умісту клітинної РНК та білка р53 у клітинах полів гіпокампа щурів із ЦД, ускладненим каротидною ішемією-реперфузією.

Цукровий діабет (ЦД) відтворювали внутрішньочеревним уведенням стрептозотоцину (Sigma, Aldrich, США, 60 мг/кг маси) білим нелінійним самцям щурів віком два міс. [3]. Двобічну каротидну ішемію-реперфузію моделювали кліпсуванням обох загальних сонних артерій протягом 20 хв. [1] у шестимісячних щурів із ЦД (т.ч. тривалість діабету становила 4 міс.) і контрольних тварин того ж віку. Ранні наслідки ішемічно-реперфузійного пошкодження гіпокампа вивчали через одну год. від початку реперфузії, а відстрочені – на 12-ту добу після моделювання ішемії.

Після декапітації тварин на холоді швидко забирали головний мозок і користуючись координатами стереотаксичного атласу [7] виділяли поля гіпокампа СА1, СА2, СА3 та СА4 і забрані взірці фіксували в 10 % розчині Буена впродовж 24 годин. Здійснювали стандартну гістологічну проводку, після чого препарати заливали в парафінові блоки, з яких готували серійні зрізи товщиною 5-6 мкм. Зрізи депарафінували, регідрували в низхідних концентраціях етанолу. Для виявлення РНК їх фарбували галлоцианін-хромовими галунами за Ейнарсоном [2]. У нейронах забраних структур мозку визначали сумарний уміст, концентрацію (в одиницях оптичної щільності, О_ОЩ) та дисперсію розподілу РНК денситометричним методом.

Білок р53 виявляли методом імунофлуоресценції. Регідровані зрізи гіпокампа впродовж 18 год. інкубували у вологій камері при 4^о С з первинними кролячими моноклональними антитілами до р53 щура та мишачими моноклональними антитілами до CD4 щура (Beckman Coulter, США), кон’югованими з FITC, промивали 0,1 М фосфатним буфером і заключали в суміш гліцерину та фосфатного буфера (9:1) для наступної люмінесцентної мікроскопії. Р53⁺-клітини гіпокампа ідентифікували за допомогою флуоресцентного мікроскопа Axioskop. Зображення вводили в комп’ютерну систему цифрового аналізу VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) [6]. Статистичну значимість відмінностей оцінювали за t-критерієм Стьюдента для незалежних виборок. Дані представлені у вигляді середніх арифметичних та стандартного відхилення.

Результати дослідження представлені в табл. 1,2.

Таблиця 1

Динаміка змін умісту РНК (од. оптичної щільності) у полях гіпокампа щурів із цукровим діабетом за умов ішемічно-реперфузійного пошкодження головного мозку (М±m)

Група cпостереження	Нейрони
	Уміст РНК на 1 мкм2	Сумарний уміст РНК
Поле СА1
Контроль	0,133±0,002	14,64±0,24
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,143±0,003*	17,80±0,448*
Ішемія-реперфузія (12 діб)	0,290±0,002*^	27,26±0,25*^
Діабет	0,148±0,002*	13,99±0,26
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,170±0,003#	16,39±0,26#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб)	0,210±0,003#&	19,33±0,27#&
Поле СА2
Контроль	0,119±0,001	12,31±0,11
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,168±0,002*	15,92±0,27*
Ішемія-реперфузія (12 діб)	0,224±0,003*^	21,85±0,29*^
Діабет	0,161±0,002*	16,35±0,22*
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,109±0,002#	11,69±0,21#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб)	0,189±0,002#&	20,32±0,27#&
Поле СА3
Контроль	0,087±0,002	10,67±0,20
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,153±0,002*	19,30±0,34*
Ішемія-реперфузія (12 діб)	0,253±0,002*^	31,62±0,34*^
Діабет	0,131±0,002*	17,01±0,24*
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,158±0,004#	20,03±0,45#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб)	0,194±0,002#&	26,24±0,33#&
Поле СА4
Контроль	0,150±0,001	12,57±0,12
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,196±0,002*	16,83±0,16*
Ішемія-реперфузія (12 діб)	0,445±0,004*^	34,48±0,29*^
Діабет	0,186±0,001*	15,96±0,12*
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год)	0,213±0,002#	17,80±0,18#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб)	0,305±0,002#&	24,76±0,18#&

Примітка: тут та в наступній табл. — вірогідність різниці порівняно з: * — контролем; ^ — ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у контрольних тварин; # — діабетом; & – ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у тварин із діабетом.

У щурів без ЦД 20-хвилинна ішемія/одногодинна реперфузія підвищила сумарний уміст та концентрацію клітинної РНК в усіх досліджених полях гіпокампа. На 12-ту добу вміст і концентрація РНК продовжували зростати. Чотиримісячний ЦД підвищив концентрацію і сумарний уміст РНК у нейронах усіх полів гіпокампа, за винятком поля СА4, де відбулося зниження цих показників. У щурів із ЦД 20-хвилинна ішемія з одногодинною реперфузією збільшила концентрацію та загальний уміст клітинної РНК у нейронах полів СА1, СА3 та СА4 і знизила – в полі СА2. Однак на 12-ту добу постішемічного періоду в нейронах усіх полів гіпокампа тварин із ЦД дані параметри зросли як щодо контролю, так і стосовно показників за раннього терміну спостереження.

Як демонструють дані табл. 2, у тварин без ЦД після 20-хвилинної ішемії/одногодинної реперфузії в усіх полях гіпокампа мала місце активація р53-залежних проапоптичних процесів, кількісно найсуттєвіша в полях СА1 та СА4. На 12-ту добу постішемічного періоду проапоптична активність стосовно контролю в полях СА1, СА2, СА3 залишалася підвищеною, а в полі СА4 – поверталася до рівня тварин контрольної групи. Чотиримісячний ЦД активував р53-залежні проапоптичні механізми в полях СА1, СА3, СА4; у тварин цієї експериментальної групи в ранньому постішемічному періоді активність р53-залежних проапоптичних процесів у полях СА1, СА3, СА4 достовірно перевищувала таку в щурів з аналогічним втручанням без діабету, а в полі СА2 була суттєво нижчою.

На 12-ту добу в щурів із діабетом активність р53-проапоптичних процесів стосовно показників за ЦД без порушення церебрального кровообігу в полі СА1 залишалася підвищеною, в полі СА2 поверталася до рівня в щурів із діабетом, а в полях СА3 та СА4 – знижувалася.

Таким чином, активація в контрольних щурів проапоптичних процесів у ранньому постішемічному періоді супроводжувалася посиленням синтетичних, про що свідчило зростання вмісту РНК. На 12-ту добу спостереження наростання вмісту РНК відбувалося на тлі відсутності динаміки проапоптичної активності. Ймовірно, можна думати про компенсаторну активацію процесів синтезу в клітинах, що вижили після ішемії.

Таблиця 2

Вплив ішемії-реперфузії на реакцію р53⁺—

клітин полів гіпокампа контрольних щурів та тварин із цукровим дiабетом (М ± m)

Група спостереження	Концентрація білка р53 ЕІФ	Площа ІРМ на 10 000 мкм2	Питомий уміст білка р53 ЕІФ
Контроль	0,0041±0,0004	220,023±26,032	0,890±0,195
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0044±0,0003	435,478±44,637*	1,851±0,178*
Ішемія-реперфузія 12 діб	0,0049±0,0005	441,657±45,205*	2,120±0,208*
Діабет	0,0037±0,0003	398,466±34,397*	1,286±0,126
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0040±0,0004	916,525±62,99# р2<0,001	3,521±0,368# р2<0,001
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб	0,0048±0,0004	632,022±59,983#&	2,928±0,227#
Поле СА2
Контроль	0,0036±0,0002	625,076±57,356	1,951±0,241
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0104±0,0009*	800,043±69,727*	8,464±3,985*
Ішемія-реперфузія 12 діб	0,0042±0,0004^	643,521±64,603	2,647±0,229*^
Діабет	0,0040±0,0003	699,684±61,109	2,283±0,200
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0047±0,0005	732,827±73,878	3,321±0,361#
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб	0,0044±0,0004	563,737±55,519&	2,064±0,311&
Поле СА3
Контроль	0,0042±0,0002	336,359±32,509	1,307±0,130
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0041±0,0001	586,773±54,216*	2,270±0,222*
Ішемія-реперфузія 12 діб	0,0037±0,0001*^	461,571±44,328*	1,674±0,139*^
Діабет	0,0031±0,0001*	663,05±67,461*	1,981±0,195*
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0033±0,0002	955,43±97,43#	2,468±0,207
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб	0,0038±0,0003#	581,898±58,612#&	1,976±0,143&
Поле СА4
Контроль	0,0041±0,0002	363,499±43,946	1,369±0,131
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0044±0,0002	701,116±73,506*	2,864±0,243*
Ішемія-реперфузія 12 діб	0,0037±0,0001	424,165±49,632^	1,497±0,273^
Діабет	0,0037±0,0007	510,595±52,065*	1,484±0,223
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год	0,0029±0,0001	892,845±87,274#	2,386±0,208#
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб	0,0033±0,0001&	373,018±39,544#&	1,185±0,246&

Примітка: вірогідність різниці порівняно з: * — контролем; ^ — ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у контрольних тварин; # — діабетом; & – ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у тварин із діабетом.

Незважаючи на те, що в щурів із ЦД в обидва терміни постішемічного періоду вміст РНК зростав на тлі посилення проапоптичної активності, це зростання, особливо в пізньому терміні спостереження, за абсолютними показниками було значно меншим, ніж у тварин без ЦД.

Висновок. У тварин без діабету активація проапоптичної активності у відповідь на ішемію-реперфузію супроводжується паралельним зростанням процесів синтезу в клітинах гіпокампа. За умов діабету в пізньому постішемічному періоді активність процесів синтезу значно нижча, ніж процесів апоптозу.

Список літератури:

1. Скибо Г.Н. Использование различных экспериментальных моделей для изучения клеточных механизмов ишемического поражения мозга / Г.Н.Скибо // Патология. – 2004. – Т.1, №1. – С. 22-30.
2. Пирс Э. Гистохимия / Э. Пирс М.: Изд-во ин. лит, 1962. – 962 с.
3. Ткачук С.С. Експресія білків Hif-1α, р53 та Bcl-2 в головному мозку за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії на тлі цукрового діабету в самців-щурів / С.С. Ткачук, О.М. Лєньков // Клінічна та експериментальна патологія. – 2010. – Т.ІХ, №2(32). – С.111–113.
4. Diabetes mellitus: a risk factor for ischemic stroke in a large biracial population / C. Khoury, D. Kleindorfer, K. Alwell [et al.] // Stroke. – 2013. – Vol.44, №6. – Р. 1500-1504.
5. Identifying Target Risk Factors Using Population Attributable Risks of Ischemic Stroke by Age and Sex /H. Park, Y. Ko, S.J. Lee [et al.] // J. Stroke. – 2015. – Vol.17, №3. – Р. 302-311.
6. Kolesnik Y.M. Image analysis system for quantitative immunofluorescence measurement / Y.M. Kolesnik, A.V. Abramov // Microscopy and Analysis. – 2002. – № 5. – P. 12–16.
7. Kоnig J. F. The rat brain. A stereotaxis atlas of forebrain and lower part of the brain stem / J. F. Kоnig, P. A. Klippel. – Baltimora: The Williams and Wilkins Company, 1963.– 162 p.[schema type=»book» name=»СПІВВІДНОШЕННЯ ПРОЦЕСІВ СИНТЕЗУ ТА АПОПТОЗУ В НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПА ЩУРІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ЦУКРОВИМ ДІАБЕТОМ, УСКЛАДНЕНИМ ГОСТРИМ ПОРУШЕННЯМ КРОВООБІГУ В БАСЕЙНІ СОННИХ АРТЕРІЙ» description=»Цель – изучить динамику соотношения содержания клеточной РНК и белка р53 в нейронах полей гиппокампа крыс с сахарным диабетом, осложненным каротидной ишемией-реперфузией. Исследование выполнено на крысах со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, осложненным 20-минутной окклюзией обеих сонных артерий. Содержание белка р53 определяли методом иммунофлуоресценции, РНК – денситометрическим методом после 20-минутной ишемии с одночасовой реперфузией и на 12-е сутки постишемического периода в полях гиппокампа СА1, СА2, СА3, СА4. У животных без диабета активация проапоптотической активности в ответ на ишемию-реперфузию сопровождается параллельным возрастанием процессов синтеза в клетках гиппокампа. В условиях диабета в позднем постишемическом периоде активность процессов синтеза значительно ниже, чем процессов апоптоза. Выводы: Сахарный диабет модифицирует соотношение процессов синтеза и апоптоза в клетках гиппокампа в ответ на ишемически-реперфузионное повреждение.» author=»Ніка Ольга Михайлівна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-01-13″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.12.16_33(2)» ebook=»yes» ]