ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИОННОГО ФАКТОРА В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Введение

Проблема биологического окисления в животном организме на клеточном и субклеточном уровне привлекает все более пристальное внимание биохимиков, физиологов и радиобиологов. Исследование обменных  процессов при анализе биологической реакции высших организмов на действие излучения дает возможность вскрыть тонкие биохимические нарушения в клетке, лежащие в основе функциональных изменений различных органов и тканей [14].

В последние годы в радиобиологической литературе появляется все большее количество экспериментальных доказательств того, что в патологии лучевой болезни имеют немалое значение нарушения в биоэнергетике живого организма. Биоэнергетика организма играет важнейшую роль в сбалансированном и сопряженном протекании биологических циклов. Энергетический обмен, в котором главную роль играют адениловые нуклеотиды, занимает центральное место в клеточном метаболизме. Любой биосинтетический и катаболический процесс сопровождается соответственно затратой и выработкой энергии, заключенной в связях макроэргических соединений, какими являются АТФ и АДФ. Кроме того, адениловые нуклеотиды являются структурными компонентами нуклеиновых кислот, участвуют в обмене коферментов [2].

Лучевые повреждения биомембран (при воздействии радиации на субклеточные структуры) сопровождаются частичным освобождением активных форм ферментов, что выражается в эффекте повышения активности ряда ферментных систем [15]. Разобщение процессов окислительного фосфорилирования, вероятно, наступает в результате выхода ряда ферментов из митохондриальных структур. Нарушение регуляции внутриклеточных механизмов может быть не только следствием, но и важнейшим звеном начальных механизмов лучевого поражения [6, 14].

Нарушения основных биохимических процессов могут усиливаться в результате развития в ядре и цитоплазме вторичных процессов в ранние сроки после облучения. Накопление некоторых метаболитов ДНК при активации процессов катаболизма может привести к угнетению отдельных ферментативных реакций ее синтеза. Изменение проницаемости мембран, происходящее после облучения, может, повлечь за собой обеднение ядра ионами металлов или некоторыми важными метаболитами. Этот процесс может привести к выходу в цитоплазму самых разнообразных ферментов. Регуляция обменных процессов после облучения нарушается не только на молекулярном, но и на структурном уровне. Развиваясь, суммируясь и взаимно влияя друг на друга, эти процессы вызывают изменения в разных тканях. Это, в свою очередь, обусловливает возникновение межтканевых и межсистемных повреждений в организме, выражением которых и являются разнообразные нарушения обмена веществ [19].

Изменения метаболизма пуриновых нуклеотидов в иммунокомпетентных клетках детерминирует состояние их функциональной активности. При этом исследования ферментов пуринового обмена открывают новые возможности биохимического подхода к коррекции больных с дефицитом ферментов, чему будет способствовать изучение их функционирования на молекулярном уровне после пылерадиационного поражения организма. Показано, что при действии ионизирующего излучения пуриновое обеспечение физиологических функций организма является неодинаковым [4].

Для глубокого понимания механизмов развития адаптационного синдрома, степени нарушения адаптивных механизмов и возможностей восстановления нарушенных функций организма,  изучение активности ферментов пуринового обмена представляет большой интерес. Особенно при воздействий на организм ионизирующего излучения у лабораторных животных. Целью нашей работы было изучение влияния воздействия гамма-облучения в отдаленном периоде на активность ферментов метаболизма пуриновых нуклеотидов 5^′-нуклеотидаза, аденозиндезаминаза (АДА), аденилатдезаминаза (АМФ-аза) в различных органах и тканях в эксперименте.

Материал и методы

Для реализации поставленной цели были выполнены 2 серии опытов на 30 лабораторных белых крысах самцах весом 220 ± 20 г. I группа – интактные (n = 15), II группа – облученные (n = 15). Животных II группы облучали однократно за 90 суток до исследования на радиотерапевтической установке Терагам ⁶⁰Сo в дозе 6 Гр.  Отдаленные последствия ионизирующего облучения исследовали через 90 дней после облучения, основываясь на литературных данных, касающихся обследования контингента людей, подвергшихся облучению в результате радиационных катастроф, ликвидаторов аварий на атомных станциях, проводившихся через 6,7,10,15 лет после катастроф и принимаемых за отдаленный период после воздействия ионизирующей радиации [3, 5, 8, 10, 11, 16]. Новоселова Е.Г. исследовала отдаленные последствия ионизирующего облучения через 1 -6 месяцев [9].

Принимая отдаленный период после воздействия ионизирующего облучения (вследствие радиационных катастроф) контингента людей за 10 лет и среднюю продолжительность жизни людей 70 лет, мы высчитали отдаленный период для крыс 3 месяца, учитывая, что продолжительность жизни крыс 2-2,5 года [17].

Для исследования выделяли лимфоциты из периферической крови и готовили гомогенаты из печени, селезенки, тимуса, лимфатических узлов тонкого кишечника и надпочечников. Приготовление гомогенатов: после декапитации животных их органы измельчали, помещали в охлажденный раствор (0° С) 0,25 М сахарозы в чашке Петри. После охлаждения ткани тщательно промывали в охлажденном 0,25 М растворе сахарозы до удаления следов крови. Затем тщательно измельченную и промытую ткань гомогенизировали на холоде, в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком в 0,25 М сахарозы, добавленной из расчета 8 мл на 1 г ткани. При гомогенизации ткани печени вращение пестика 600 об/мин в течение 25 сек. Гомогенаты тканей фильтровали через слой стерильной марли и центрифугировали 3000 об/мин в течение 30 минут при  температуре 0-2° С для удаления обрывков. Пробирки с гомогенатами находились во льду на всем протяжении исследования активности ферментов [12].

У всех животных определяли 5^′-нуклеотидазы, аденозиндезаминазы и АМФ-дезаминазы. Активность 5^′-нуклеотидазы определяли по методу И.Д. Мансурова, Р.З. Стокмана [7], аденозиндезаминазы и АМФ-дезаминазы проводили методом, разработанным Тапбергеновым С.О. [13]. Полученные результаты исследования обрабатывались методами вариационной статистики с вычислением критериев t-Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В ходе исследований выявлено, что активность 5^′-нуклеотидазы в селезенке у облученных животных в отдаленном периоде, по сравнению с контрольной группой, снижена на 89,33 % (р˂0,001). Активность аденозиндезаминазы у контрольных животных регистрировалась в пределах 1,51±0,08 нмоль/с на мг белка, тогда как у животных II группы находилась в пределах 0,32 ± 0,03 нмоль/с на мг белка (р˂0,05), снижена на 76 % сравниваемого показателя. У животных после радиации в отдаленном периоде уровень АМФ-дезаминазы имела тенденцию к снижению (р˂0,05). Таким образом, в отдаленном периоде после облучения наблюдалось снижение уровня контроля по активности 5’-нуклеотидазы, АДА и АМФ-азы в гомогенате селезенки.

Активность 5^′-нуклеотидазы в лимфатических узлах тонкого кишечника у животных II группы понижена на 40% (р˂0,001). Активность аденозиндезаминазы у облученных животных в отдаленном периоде, по сравнению с контрольной группой, в лимфатических узлах тонкого кишечника  снижена на 73,76 % (р˂0,001), а активность фермента АМФ-дезаминазы была повышена более чем в 3 раза по сравнению с контрольными величинами (р˂0,001).

Лучевое разобщение процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях непосредственно обуславливает нарушение обмена макроэргических соединений. Наиболее ранние и резко выраженные изменения содержания адениловых нуклеотидов после облучения наблюдаются в тканях лимфоидной системы и кроветворных органов. В частности, в лимфатических узлах и тимусе крыс уровни АТФ, АДФ и АМФ снижаются уже через 15 минут после облучения в дозе 6-10 Гр [1].

Снижение уровня контроля по активности 5’-нуклеотидазы, АДА и АМФ-азы, свидетельствует о преобладании распада АМФ путем дезаминирования. Большое значение для функционирования лимфоцитов имеет 5^′-нуклеотидаза, локализованная в мембране клеток, обеспечивающая поступление аденозина из внеклеточной среды. Она является маркерным ферментом плазматической мембраны, при снижении ее активности аденозин поступает в недостаточном количестве, что приводит к истощению энергетических ресурсов клетки. Имеются сведения, что врожденная недостаточность 5^′-нуклеотидазы связана с отсутствием зрелых В-лимфоцитов и низким уровнем сывороточных иммуноглобулинов [18].

Образование аденозина в клетках при гидролизе АТФ, возможно, обусловлено невысокой активностью 5^′-нуклеотидазы, которая поступает в клетку в результате интернализации эктофермента, либо находится в ней независимо от этого процесса. При  облучении в иммунокомпетентных органах происходило снижение активности 5^′-нуклеотидазы, что обусловливало накопление аденозина, с последующими изменениями адаптационных механизмов.

Изменения наблюдались со стороны пуринового обмена в тимусе при радиационном факторе воздействия. Активность 5^′-нуклеотидазы у облученных животных в отдаленном периоде в тимусе понижена на 45% по сравнению с контрольной группы (р˂0,01), а активность АДА в более чем 2 раза понизились контрольные значения (р˂0,001), активность АМФ-дезаминазы достоверно повышался на 38 % по сравнению с контрольной группы (р˂0,05).

Результаты исследования показали, что у животных после радиационного воздействия в отдаленном периоде активность ферментов аденозиндезаминазы и АМФ-дезаминазы в печени по сравнению с контрольной группой возросла более чем в 2 раза (р˂0,01). В ходе исследования выявлена достоверное увеличение активность 5^′-нуклеотидазы, аденозиндезаминазы и АМФ-дезаминазы в лимфоцитах периферической крови (р˂0,01).

Активность ферментов 5^′-нуклеотидазы, аденозиндезаминазы в надпочечниках у животных, подвергавшихся радиационному воздействию, достоверно превышала аналогичные данные контрольной группы: активность 5^′-нуклеотидазы почти на 1,5 раза (р˂0,05), активность аденозиндезаминазы на более 2 раза (р˂0,01).

На основании полученных данных, мы можем сказать, что ткани надпочечника и лимфоциты периферической крови на действие радиационного фактора отвечают значительным усилением процессов анаболизма и катаболизма в отдаленном периоде, что может указывать на вторичный характер обнаруженных изменений. Указанные изменения в определенной мере связаны с нейрогуморальными механизмами в облученном организме, в частности, с реакцией гипоталамо-гипофиз-адреналовой системой на действие ионизирующей радиации. Известно, что надпочечники играют ведущую роль в реализации неспецифических реакций организма при действии раздражителей посредством выброса катехоламинов и глюкокортикоидов. Активация обменных процессов в надпочечниках после радиационного воздействия, участвующего в регуляции пуриновых нуклеотидов и энергообеспечении органа, вероятно, способствуют увеличению продукции гормонов.

Таким образом, важным аспектом обмена нуклеотидов в облученном организме является усиление их катаболизма. Лучевое изменение и разобщение окислительного фосфорилирования в исследуемых органах является результатом непосредственного воздействия радиации на структуру и функцию органелл клетки. Можно констатировать, что воздействие радиации вызывает значительные нарушения ферментов пуринового обмена, что характеризует напряжение адаптационно-компенсаторных механизмов организма на воздействие изученного радиационного фактора. Исследования показывают, что в отдаленном периоде, после воздействия ионизирующей радиации происходит относительная активация катаболитических процессов, практически во всех исследуемых органах, что позволяет предположить возможность репарации обменных процессов облученного организма в отдаленном периоде, за счет компенсаторных возможностей организма.

Список литературы:

1. Байсахатов Р., Хансон К.П. Сопоставление содержания адениловых нуклеотидов и активности процесса окислительного фосфорилирования в тимусе крыс после облучения // Радиобиология. – 1972. — № 1. — С.107-109.
2. Елисеев В.В., Полтавченко Г.М. Роль аденозина в регуляции физиологических функций организма // Биохимия. – 1991. — № 3. — С. 72-74.
3. Жаков И.Г., Океанов А.Е., Стежко В.А. Заболеваемость сельского населения Гомельской области злокачественными новообразованиями после аварии на ЧАЭС // Мед. радиол. и радиац.безопастность. – 1997. – Т. 42. — №6. — С.34-36.
4. Жетписбаев Б.А., Хамитова Л.К. Иммунные дисфункции облученного организма. – Алматы, 2000. — 215 с.
5. Корнеев А.Г., Журков В.С., Кулешов П.П. и соавт. Радиоэкологическая и генетическая оценка отдаленных последствий Тоцкого ядерного взрыва // Радиационная гигиена. – 1992. — №6. — С.46-50.
6. Кулаев С.Р., Треногина В.Я., Аленова А.Х. и соавт. Состояние туберкулезной эпидемии в экологически неблагополучных районах Казахстана. //Тезисы докладов XI съезда фтизиатров, – СПб, 1994. — С. 317.
7. Мансуров И.Д., Стокман Р.З. К методике определения активности 5’-нуклеотидазы в сыворотке крови // Лабораторное дело. – 1973. — № 4. — С.228–229.
8. Надежина Н.М., Галстян И.А., Савицкий А.А. Отдаленные последствия острой лучевой болезни // Мед. радиол. и радиац.безопастность. – 2002. – Т.47, № 3. — С.17.
9. Новоселова Е.Г. Обмен фосфолипидов в лимфоидных клетках в отдаленные сроки после сублетального гамма-облучения крыс // Радиобиология. – 1991. – Т.31, № 3. — С.352-355.
10. Серкиз Я.И., Якша-Слюсарева Е.А. Отдаленные последствия, возникающие у крыс содержащихся в условиях постоянного воздействия малых доз ионизирующих излучений низких интенсивностей //Тезисы докладов 1 всесоюз. радиобиол. съезда. — Пущино, 1989, 4. — С. 854-855.
11. Суворов Л.А., Гордеева А.А. Состояние гемопоэза в ранние и отдаленные сроки острой лучевой болезни //Мед. радиол. и радиац.безопасность. – 2000. — Т. 45, №6. — С.5-9.
12. Тапбергенов С.О. К методике определения СДГ — активности митохондрий крыс // В кн.: Вопросы физиологии и морфологии человека и животных. Семипалатинск, 1971. — С. 222-223.
13. Тапбергенов Т.С., Тапбергенов С.О. Современные основы энзимной диагностики. Руководство для врачей: Семипалатинск, 2001. 34с.
14. Утешев А.Б. Роль окислительно-восстановительных ферментов при радиационном поражении. Алма-ата: Наука, 1981. — 147 с.
15. Утешев А., Аргынбекова О.. Мусайнова А. и соавт. Состояние биохимических процессов в печени, селезенке и надпочечниках крыс в отдаленном периоде //Астана медициналык журнал. – 2005. — № 3. — С. 77-78.
16. Ушакова Т.И, Аксель Е.М., Бугаева А.Р. Оценка заболеваемости злокачественными новообразованиями детского населения Тульской области через 10 лет после аварии на ЧАЭС // Мед. радиол. и радиац.безопасность. — 2000. – Т. 45, № 5. — С.42-46.
17. Флиндт Р. Биология в цифрах. — М.: Мир, 1992, 303 с.
18. Хансон К.П., Байсахатов Р. Исследование количественного содержания адениловых нуклеотидов в подчелюстных лимфатических узлах крыс, подвергнутых общему рентгеновскому облучению в различных дозах // Радиобиология. – 1973. — №2. — С. 274-277.
19. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. – М.: Высш. шк., 2004. — 549 с.[schema type=»book» name=»ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИОННОГО ФАКТОРА В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ» description=»Изучение влияния гамма-облучения в отдаленном периоде на активность ферментов метаболизма пуриновых нуклеотидов 5′-нуклеотидаза, аденозиндезаминаза, аденилатдезаминаза в различных органах и тканях в эксперименте. Эксперименты проведены на 30 лабораторных белых крысах. I группа ¬– интактные, II группа – облученные. Радиационное воздействие вызывает значительное нарушение ферментов пуринового обмена, что характеризует напряжение адаптационно-компенсаторных механизмов организма на воздействие изученного фактора. Происходит относительная активация катаболитических процессов, что позволяет предположить возможность репарации обменных процессов организма в отдаленном периоде, за счет компенсаторных возможностей организма.» author=»Ильдербаев Оралбек Зайнулданович, Шапекова Нэля Лукпановна, Ильдербаева Гулжан Оралбековна, Нурмуканов Дулат Кабденович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-01-09″ edition=»euroasia-science.ru_29-30.12.2015_12(21)» ebook=»yes» ]