Сахарный диабет 1 типа (СД1) – полигенное многофакторное заболе-вание, развитие которого связано с аутоиммунной деструкцией β-клеток поджелудочной железы.
Генетическая предрасположенность играет определяющую роль в механизмах манифестации и прогрессирования аутоиммунного воспаления при СД1 [2, 4].
К настоящему времени выявлено 20 генов, находящихся на разных хромосомах, которые в той или иной степени предрасполагают к СД1. Некоторые из них ассоциированы не только с СД1, но и с другими аутоиммунными заболеваниями (АИЗ), такими как АИЗ щитовидной железы (АИЗ ЩЖ), болезнь Аддисона, целиакия, системная красная волчанка, ревматоидный артрит [8, 9].
Наибольший вклад в предрасположенность к СД1 и другим АИЗ принадлежит локусу IDDM1, на котором находятся гены главного комплекса гистосовместимости HLA II класса [2]. Расположенный на коротком плече 6 хромосомы (6p21), локус HLA II класса у людей, по оценкам ученых, вносит примерно 40-50% от общего вклада в наследственный риск развития СД1.
Многочисленные исследования показали сильное влияние наряду с генами HLA II класса, гена CTLA-4 на совместную предрасположенность к СД1 и АИЗ ЩЖ в семьях и у одного и того же человека [5, 12].
Ген CTLA-4 занимает около 6,2 kb на второй хромосоме (2q33) и состоит из 4 экзонов. Он кодирует рецептор Т-клеток, который взаимодействует с молекулами В7-1 (СD80) и B7-2 (CD86), расположенными на поверхности клеток, представляющих антиген. Связывание CTLA-4 с молекулами В7 играет ключевую роль в негативной регуляции активации Т-клеток, практически прекращает процесс активации и оставляет Т-клетки в состоянии периферической толерантности.
В многочисленных работах, посвященных патогенетической роли гена CTLA-4, была обнаружена ассоциация ряда однонуклеотидных полиморфизмов данного гена с развитием СД1 [7], диффузного токсического зоба (ДТЗ) [10] и аутоиммунного тиреоидита (АИТ) [11].
Наиболее часто в литературе упоминаются два полиморфизма гена CTLA-4 — rs 231775 (49 A/G) и rs 3087243 (CT60 A/G). Первый из них — более исследованный полиморфизм, расположенный в первом экзоне гена CTLA-4, характеризуется заменой треонина на аланин в 17 кодоне лидерного пептида и ассоциирован со многими заболеваниями [1, 3].
Полиморфный маркер rs 3087243, расположенный в промоторной области гена CTLA-4, был исследован ранее, в основном, в связи с риском развития АИЗ, кодирует антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов и отвечает за уровень активации Т-клеток [3].
Задачей настоящего исследования является сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов двух полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 с оценкой их взаимовлияния у пациентов с СД1 и пациентов, имеющих сочетание СД1 с АИЗ ЩЖ.
Материалы и методы
В исследование было включено 249 пациентов с СД1, которые находились на обследовании и лечении в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ. Все пациенты были разделены на 3 группы: в первую группу вошло 89 пациентов с СД1 и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) (средний возраст пациентов 33,0±14,0 лет, из них мужчин — 13 (0,146), женщин – 76 (0,854)), вторую группу составили 22 пациента с СД1 и диффузным токсическим зобом (ДТЗ) (средний возраст пациентов 33,1±16,4 лет, из них мужчин — 7 (0,318), женщин – 15 (0,682)), в третью группу вошло 138 пациентов с СД1 и отрицательными титрами антител к ткани щитовидной железы (АтЩЖ) (средний возраст пациентов 24,2±12,9 лет, из них мужчин — 68 (0,491), женщин – 15 (0,682)). Контрольную группу составили 108 человек из Московской популяции без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним, средний возраст в контрольной группе (n=108) – 46,3±9,3лет, мужчин 73 (68%), женщин – 35 (32%). У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение дан-ного исследования.
HLA-генотипирование по аллельным вариантам гена DRB1 HLA II класса выполнялось методом сиквенс-специфических праймеров с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения полиморфных аллелей данного гена применялись коммерческие наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия). Амплификацию производили на амплификаторах «Терцик» (Россия).
Типирование однонуклеотидных полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флюоресцентными метками и автоматической регистрацией результатов реакции в режиме реального времени (real-time PCR) наборами компании «ДНК-Технология» (Москва) на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология») в соответствии с инструкциями производителя.
Количественное определение титров аутоантител к тиреоглобулину (ATG) и тиреопероксидазе (ATPO) в сыворотках крови осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Biomerica» (лаборатория клинической биохимии ФГБУ «Эндокринологи-ческий научный центр» МЗ РФ, зав. – А.В. Ильин).
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных подходов, используемых при проведении популяционно-генетических исследований.
Показатели «отношения шансов» (OR-odds ratio) с 95% доверительным интервалом (95% CI) рассчитывались для «редкого» аллеля, носителей «редкого» аллеля (гетерозигот + гомозигот по «редкому» аллелю) относительно «частых» аллелей и гомозигот по «частому» аллелю соответственно. Аналогичный расчет проводился для гомозигот по «редкому» аллелю относительно гетерозигот и гомозигот по «частому» аллелю.
Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводилось с использованием критерия Краскела-Уоллиса и точного двустороннего критерия Фишера.
Отношение рисков (RR-related risk) рассчитано как отношение риска наступления события (СД1) у лиц, имеющих фактор риска (определенное сочетание генотипов) по отношению к контрольной группе.
Результаты и их обсуждение
В предыдущем исследовании нами была получена ассоциация СД1 с G(GG) в rs 231775 гена CTLA-4, что согласуется с результатами других исследователей [3, 6]. При этом мы не получили доказанную ассоциацию данного полиморфизма с СД1 в сочетании с АИТ. Для полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 нами не было выявлено достоверной ассоциации ни с одной из исследованных групп, что, скорее всего, было связано с их малочисленностью. В связи с этим, мы увеличили выборку и провели аналогичные исследования.
Между группами СД1 в сочетании с АИТ и СД1 в сочетании с ДТЗ по обоим исследуемым полиморфизмам гена CTLA-4 различий обнаружено не было. Поэтому при дальнейшем анализе группы объединялись в одну общую с целью увеличения выборки и улучшения качества анализа.
Исследование частоты встречаемости однонуклеотидной замены 49 A/G (rs 231775), расположенной в первом экзоне гена CTLA4.
Результаты исследования частот полиморфных вариантов гена CTLA4 в выборке пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ, с сочетанием СД1 и АИЗ ЩЖ и случайной (контрольной) выборке представлены в таблице 1. Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованному локусу гена CTLA-4 в контрольной выборке соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга (p=0,78).
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля G среди больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 148/268 (55%) по сравнению со здоровыми лицами 91/216 (42%) (OR=1,69, 95% CI: 1,18–2,43, р=0,005) (таблица 1).
Таблица 1.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ и в контрольной группе
| Группы | Частота генотипов, абс./отн. | Частота аллелей, абс./отн. | |||||
| AA | AG | GG | Всего: | A | G | Всего: | |
| СД1+АИТ (88) | 31/0,35 | 35/0,4 | 22/0,25 | 88/1 | 97/0,55 | 79/0,45 | 176/1 |
| СД1+ДТЗ (22) | 4/0,18 | 12/0,55 | 6/0,27 | 22/1 | 20/0,45 | 24/0,55 | 44/1 |
| СД1+АИЗ ЩЖ (110) | 35/0,318 | 47/0,427 | 28/0,255 | 110/1 | 117/0,532 | 103/0,468 | 220/1 |
| СД1 (134) | 28/0,21 | 64/0,48 | 42/0,31 | 134/1 | 120/0,45 | 148/0,55 | 268/1 |
| Контроль (108) | 35/0,32 | 55/0,51 | 18/0,17 | 108/1 | 125/0,58 | 91/0,42 | 216/1 |
Как следует из представленной таблицы, частота носителей «редкого» аллеля G у больных СД1, серонегативных по АтЩЖ (лица с генотипами АG и GG), была незначимо выше – 57/70 (81%), чем в группе контроля – 73/108 (68%) (относительно лиц с генотипом АА – OR=2,1, 95% CI: 1,02-4,34, p=0,063). При этом частота генотипа GG достоверно выше в группе пациентов (34%) по сравнению с группой контроля (17%), p=0,0116, OR=2,1, 95% CI: 1,21-3,5. Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом CTLA-4 rs 231775 и предрасположенностью к развитию СД1, серонегативного по АтЩЖ, в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана-Армитажа) показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (p=0,004), что свидетельствует о наличии тенденции к повышению степени ассоциации генотипа с риском развития изолированной формы СД1 при увеличении в генотипе количества аллелей G. Вывод о том, что носители аллеля G и генотипа GG имеют повышенный риск развития СД1 согласуется с данными ряда исследователей [1, 3].
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 среди больных СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ и доноров не выявил статистически значимых различий (p=0,32 для «редких» аллелей, p=0,34 для носителей «редкого» аллеля и p=0,34 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю).
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 гена CTLA-4 выявил повышение встречаемости «редкого» аллеля G среди больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 148/268 (55%), по сравнению с пациентами, страдающими СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ, — 103/220 (46,8%) (OR=2,29, 95% CI: 1,39–3,77, р=0,0016).
Частота носителей «редкого» аллеля G у больных СД1, серонегативных по АтЩЖ (лица с генотипами АG и GG), была достоверно выше – 57/70 (81%), чем в группе СД1+АИЗ ЩЖ – 33/60 (55%), OR=3,59, 95% CI: 1,63-7,89, p=0,0022. При этом частота генотипа GG недостоверно выше в группе пациентов (34%) по сравнению с группой контроля (20%), p=0,11, OR=1,7, 95% CI: 0,94-3,13. Оценочный тест для анализа изменения степени ассоциации между генотипом CTLA-4 rs 231775 и определенной клинической формой СД1, в зависимости от числа полиморфных аллелей (тренд-тест Кохрана-Армитажа) показал статистически значимые различия между сравниваемыми генотипами (p=0,002), что свидетельствует о наличии тенденции к высокой степени ассоциации генотипа данного полиморфизма с клинической формой СД1.
Исследование частоты встречаемости однонуклеотидной замены CT60 A/G (rs 3087243), расположенной в промоторной области гена CTLA4.
Наблюдаемое распределение частот генотипов по исследованному локусу гена CTLA-4 в контроле соответствует теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга (p=0,67).
При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 нами установлена высоко достоверная ассоциация данного маркера с изолированным СД1, что согласуется с данными других исследователей [3]. При этом аллель G полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 значимо чаще встречается у пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ по сравнению с группой контроля — p=0,01 для «редких» аллелей и носителей «редкого» аллеля и p=0,02 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю (OR (G)=1,61, 95% CI: 1,1-2,37, OR (GG)=1,65, 95% CI: 0,98-2,76; RR (G)=1,29, 95% CI: 1,06-1,56) (таблица 2).
Таблица 2.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ и в контрольной группе
.
| Группы | Частота генотипов, абс./отн. | Частота аллелей, абс./отн. | |||||
| AA | AG | GG | Всего: | A | G | Всего: | |
| СД1+АИТ (64) | 8/0,125 | 23/0,36 | 33/0,515 | 64/1 | 39/0,31 | 89/0,69 | 128/1 |
| СД1+ДТЗ (12) | 2/0,17 | 3/0,25 | 7/0,58 | 12/1 | 7/0,29 | 17/0,71 | 24/1 |
| СД1+АИЗ (76) | 10/0,132 | 26/0,342 | 40/0,526 | 76/1 | 46/0,303 | 106/0,697 | 152/1 |
| СД1 (129) | 10/0,08 | 53/0,41 | 66/0,51 | 129/1 | 73/0,28 | 185/0,72 | 258/1 |
| Контроль (108) | 18/0,17 | 48/0,44 | 42/0,39 | 108/1 | 84/0,39 | 132/0,61 | 216/1 |
Вместе с тем, анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 среди больных СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ и доноров не выявил статистически значимых различий (p=0,09 для «редких» аллелей и носителей «редкого» аллеля и p=0,11 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю). Мы также не выявили значимых отличий по данному полиморфизму между группами пациентов с СД1, серонегативных по АтЩЖ и СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ (p=0,67 для «редких» аллелей и носителей «редкого» аллеля и p=0,68 для генотипов, гомозиготных по «редкому» аллелю).
В настоящее время не решен вопрос о взаимном влиянии отдельных локусов гена CTLA-4 и вкладе их белковых продуктов в формирование аутоиммунного воспаления. В этой связи мы провели анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ и в контрольной группе (таблица 3).
Таблица 3.
Распределение частот сочетаний генотипов полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с СД1, СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ и в контрольной группе
.
|
|
GG-AA | GG-AG | GG-GG | AG-GG | AG-AG | AG-AA | AA-AA | AA-AG | AA-GG |
| СД1+АИТ (64) | 0
|
0 | 17/0,265
|
13/0,203 | 12/0,188 | 0 | 8/0,125 | 11/0,172 | 3/0,047 |
| СД1+ДТЗ (12) | 0 | 0 | 4/0,33 | 3/0,25 | 2/0,17 | 0 | 2/0,17 | 1/0,08 | 0/0 |
| СД1+АИЗ ЩЖ (76) | 0 | 0 | 21/0,276 | 16/0,21 | 14/0,184 | 0 | 10/0,132 | 12/0,158 | 3/0,04 |
| СД1 (129) | 0 | 0 | 41/0,319 | 24/0,186 | 38/0,295 | 0 | 10/0,076 | 15/0,116 | 1/0,008 |
| Контроль (108) | 0 | 0 | 18/0,167 | 19/0,176 | 36/0,333 | 0 | 18/0,167 | 12/0,111 | 5/0,046 |
Согласно данным, представленным в таблице 3, имеются значимые отличия для сочетаний генотипов GG—GG полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 между группой пациентов с СД1 и контролем (OR (GG—GG) = 2,33 (1,24-4,36); RR (GG—GG) = 1,41 (1,12-1,76), p=0,01). Каких-либо других значимых отличий между исследуемыми группами в данном исследовании получено не было.
Выводы:
Таким образом, полученные нами данные согласуются с нашими данными, полученными ранее на меньшей выборке пациентов и подтверждают результаты других исследователей о том, что СД1 ассоциирован с G(GG) в rs 231775 гена CTLA-4. При этом мы вновь не получили доказанную ассоциацию данного полиморфизма с СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ.
Пациенты, имеющие сочетание СД1 с АИЗ ЩЖ, по распределению аллелей и генотипов полиморфизма rs 231775 ближе к норме по сравнению с пациентами с изолированным СД1.
Нами установлено достоверное увеличение частоты аллеля G (p=0,01) и генотипа GG (p=0,02) полиморфизма rs 3087243 гена CTLA-4 в группе пациентов с изолированным СД1 по сравнению с контролем, что свидетель-ствует об ассоциации данных аллеля и генотипа с повышенным риском разви-тия СД1.
Сочетание генотипов GG—GG по полиморфизмам rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4, соответственно, достоверно чаще встречается при изолированном СД1 по сравнению с группой контроля (p=0,01).
Список литературы
- Абрамов Д.Д., Дедов И.И., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Кураева Т.Л., Алексеев Л.П. Полиморфизм гена CTLA-4 (49А/G) в русской популяции у больных сахарным диабетом 1 типа и здоровых доноров // Сахарный диабет. – 2007. — № 3. – С. 5—8.
- Алексеев Л.П., Дедов И.И., Хаитов Р.М., Болдырева М.Н., Шестакова М.В., Петеркова В.А., Кураева Т.Л., Прокофьев С.А. Клиническая значимость определения HLA—DRB1-генотипов, ассоциированных с предрасположенностью или устойчивостью к сахарному диабету 1 типа в различных этнических группах России. // Сахарный диабет. – 2007. — № 3. – С. 2-5.
- Бровкина О.И. Исследование ассоциации генов-кандидатов с сахарным диабетом 1 типа и диагностическая тест-система для ранней диагностики риска развития сахарного диабета 1 типа: Автореф. дис. канд. мед. наук. — Москва, 2012. – 22 с.
- Дедов И.И., Шестакова М.В. Сахарный диабет: рук-во для врачей. – М.: Универсум паблишинг, 2003. – С. 77-81.
- Репина Е.А. Общие генетические маркеры сахарного диабета 1 типа и аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. // Сахарный диабет. – 2011. — № 2. – С. 23-30.
- Репина Е.А., Болдырева М.Н., Сунцов Ю.И., Батенева Е.И., Кадочникова В.В., Ильин А.В., Трошина Е.А. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs 231775 и rs 3087243 гена CTLA-4 у пациентов с сахарным диабетом 1 типа и сахарным диабетом 1 типа в сочетании с аутоиммунным тиреоидитом. // Фундаментальные исследования. – 2014. — № 10 (часть 6). – C. 1171-1176.
- Dittmar M., Kahaly G.J. Polyglandular autoimmune syndromes: immunogenetics and long-term follow-up. // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2003. – Vol. 88. – P. 2983–2992.
- Eisenbarth G.S., Gottlieb P.A. Autoimmune polyendocrine syndromes. // N. Engl. J. Med. – 2004. – Vol. 350. – P. 2068–2079.
- Encinas J.A., Kuchroo V.K. Mapping and identification of autoimmunity genes. // Curr. Opin. Immunol. – 2000. – Vol. 12. – P. 691–697.
- Huber A., Menconi F., Corathers S., Jacobson E.M., Tomer Y. Joint genetic susceptibility to type 1 diabetes and autoimmune thyroiditis: from epidemiology to mechanisms. // Endocr. Rev. – 2008. – Vol. 29. – P. 697–725.
- Levin L., Tomer Y. The etiology of autoimmune diabetes and thyroiditis: evidence for common genetic susceptibility. // Autoimmun. Rev. – 2003. – Vol. 2. – P. 377–386.
- Sougioultzoglou F., Falorni A., Kassi G., Brozzetti A., Karamitsos D., Koliakos G.G. Coincidence of high antiislet and antithyroid autoantibody titles in first-degree relatives of patients with type 1 diabetes. // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. – 2005. – Vol. 113. – P. 85–89.[schema type=»book» name=»ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФИЗМОВ rs 231775 И rs 3087243 ГЕНА CTLA-4 С ОЦЕНКОЙ ИХ ВЗАИМОВЛИЯНИЯ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА И САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА В СОЧЕТАНИИ С АУТОИММУННЫМИ ТИРЕОПАТИЯМИ» author=»Репина Екатерина Александровна, Болдырева Маргарита Николаевна, Сунцов Юрий Иванович, Трошина Екатерина Анатольевна » publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-04-04″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.04.2015_4(13)» ebook=»yes» ]