Site icon Евразийский Союз Ученых — публикация научных статей в ежемесячном научном журнале

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I С АКТИНОМИЦИНОМ Д И ВИНБЛАСТИНОМ

euroasia

На сегодняшний день возрос интерес к изучению свойств липопротеинов и их белковых компонентов как естественных транспортных систем крови. Такой интерес обусловлен их способностью образовывать устойчивые взаимодействия с различными биологически-активными соединениями, в том числе лекарственными препаратами. Показана способность липопротеинов осуществлять транспорт некоторых препаратов цитостатического действия [1, с. 50]. Одной из уникальных особенностей липопротеинов является возможность образования комплексов с липопфильными и водорастворимыми соединениями и наличие рецепторов к ним практически во всех органах и тканях организма. В НИИ биохимии СО РАМН было показано, что большой вклад в образование комплексов вносят белковые компоненты липопротеинов – аполипопротеины. Из целого ряда аполипопртеинов наиболее перспективным, как комплексообразователь, показал себя основной белковый компонент липопротеинов высокой плотности аполипопротеин А-I. Были получены данные о способности   апоА-I образовывать комплексы с различными биологически активными соединениями: стероидными гормонами, витаминами, противоопухолевыми препаратами [2, с. 23; 3, с. 364]].

Целью данного исследования явилось исследование возможности аполипопротеина А-I  образовывать комплекс с противоопухолевыми препаратами актиномицином Д и винбластином.

Выделение липопротеинов  из плазмы крови человека проводили методом ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na2 [4, с. 33]. Фракцию липопротеинов высокой плотности (ЛПВП, 1,063<d<1,21 г/мл) делипидировали смесью хлороформ-метанол (1:1) с многократной отмывкой эфиром. Смесь белков разделяли методом колоночной хроматографии, элюент: 6 М мочевина, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид. Проверка чистоты аполипопротеина А-I осуществлялась с помощью электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом Na (SDS Na)  [5, с. 680]. Обессоливание белка проводили методом гель-фильтрации. В качестве элюента использовали 5 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.

Рис. 1. Электрофореграмма хроматографической очистки

аполипопротеина А-I.

1  –  низкомолекулярные белки-стандарты;

2  –  суммарные белки ЛПВП;

3-6 – стадии очистки апоА-I.

В работе использовали 1 мМ раствор актиномицина Д и винбластин. Взаимодействие апоА-I с  актиномицином Д изучали методом спектрофлуоримерии при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне от 300 до 450 нм. Титрование проводили добавлением аликвот противоопухолевого препарата (по 10 мкл) к 2 мл аполипопротеина А-I. Расчет константы связывания осуществляли по методу Аттала и Лата [6, с. 325].

Методом тушения триптофановой флуоресценции показано взаимодействие липопротеинов  высокой плотности и аполипопротеина А-I с актиномицином Д и винбластином. Снижение флуоресценции  составило от 73% до 88%.  Данное снижение можно расценивать как результат образования комплекса липопротеинов высокой плотности с актиномицином Д и винбластином, а также аполипопротеина А-I с актиномицином Д и винбластином (Рис. 2,3).

Рисунок 2. Спектры триптофановой  флуоресценции аполипопротеина А-I в комплексе с актиномицином Д

1- Аполипопротеин А-I;

2-  Актиномицин Д;

3-9 – добавление аликвот актиномицина Д к аполипопротеину А-I.

Рисунок 3. Спектры триптофановой  флуоресценции аполипопротеина А-I в комплексе с винбластином

1- Аполипопротеин А-I;

2-  винбластин Актиномицин Д;

3-9 – добавление аликвот винбластина к аполипопротеину А-I.

Рассчитано количество молекул противоопухолевых препаратов, которое может быть связано с ЛПВП и апоА-I, оно составило 26 и 28 молекул актиномицина и винбластина  на один моль ЛПВП, 12 и 45 молекул актиномицина и винбластина на 1 молекулу  аполипопротеина А-I. Полученные данные позволили нам сделать предположение о возможности использования ЛПВП и аполипопротеина А-I в качестве эффективной транспортной формы актиномицина Д и винбластина. Произведен расчет констант ассоциации для комплексов апоА-I-винбластин – 3,8  х 105 М-1 и апоА-I – актиномицин Д — 1,4 х 105 М-1, которые указывают на то, что связывание белок-лиганд не является высокоспецифичным, однако это может оказаться положительным моментом при освобождении противоопухолевого препарата после доставки его в опухолевую клетку. Количество мест связывания представляет широкий диапазон регулирования дозировки препарата.

Литература:

404: Not Found404: Not Found