настоящее время в сточных, природных водах и даже питьевой воде все чаще обнаруживаются лекарственные средства и продукты их разложения [1]. Так, в 2011 году в водных источниках Германии впервые был обнаружен кодеин [2]. В связи с этим актуальной аналитической задачей является разработка способов детектирования фармполлютантов и их метаболитов в объектах окружающей среды. В последние годы показано, что эффективными биодеструкторами фарполлютантов и кодеина, в частности, являются актинобактерии рода Rhodococcus, которые относятся к обычным компонентам техногенно-загрязненных сред [3]. Поскольку пробы сточных и природных вод представляют собой, как правило, многокомпонентные смеси, то наиболее рациональным методом определения в них лекарственных средств является высокоэффективная жидкостная хроматография.
В связи с этим, в настоящей работе приводятся условия количественного определения кодеина фосфата (КФ) в постферментационной среде культивирования родококков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также результаты исследования динамики процесса биодеструкции КФ штаммом R. rhodochrous ИЭГМ 647 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур (WFCC) #768, www.iegm.ru/iegmcol), изолированным из нефтезагрязненной воды [3].
Анализ образцов культуральной жидкости выполняли на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» («Эконова», Россия) со спектрофотометрическим детектором и металлической хроматографической колонкой (2×75 мм), упакованной обращенно – фазным сорбентом ProntoSIL-120-5-C18 AQ (размер зерен 5 мкм). Регистрацию и обработку хроматографической информации осуществляли с помощью программы «Мультихром» (ЗАО «Амперсенд», Москва).
При разработке методики хроматографического определения КФ в культуральной жидкости родококков использовали 0,004% раствор КФ в фосфатном буферном растворе состава (г/л) Na2HPO4-8,9; KH2PO4-3,39 (рН 7,0), а также фосфатный буферный раствор, полученный при культивировании родоккков in vitro, и содержащий КФ, его метаболиты и продукты жизнедеятельности бактериальных клеток.
Пробы культуральных жидкостей в количестве 1 мл центрифугировали при 12000 об/мин в течение 3 мин («Mini Spin», Германия). Для анализа проб использовали 10 мкл надосадочной жидкости.
Идентификацию КФ на хроматограммах проводили по времени удерживания и спектральным соотношениям, полученным при многоволновом детектировании, в сравнении с 0,004% раствором КФ в среде фосфатного буфера.
На рис. 1 представлены хроматограммы раствора стандартного образца КФ (0,004%) в фосфатном буферном растворе (А) и КФ в культуральной жидкости после 30 сут процесса биодеструкции.
Рис. 1. Хроматограммы КФ в фосфатном буферном растворе (А) и КФ в фосфатном буферном растворе после 30 сут ферментации (Б).
При сравнении хроматограмм наблюдается совпадение пиков КФ и одинаковое время удерживания КФ (5,23 ± 0,02 мин).
Таким образом, для разделения образующейся в процессе биодеструкции КФ многокомпонентной системы предложены следующие условия хроматографического анализа: подвижная фаза – 0,1% раствор трифторуксусной кислоты; скорость потока элюента – 100 мкл/мин; режим элюирования – градиентный; детектирование многоволновое — 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм; температура термостата колонки –40°С; объем вводимой пробы – 10 мкл.
Разработанная методика была использована для оценки содержания КФ в культуральной жидкости родококков в процессе биодеструкции КФ (табл. 1). Расчет содержания КФ в культуральных жидкостях проводили методом внешнего стандарта по площади хроматографических пиков относительно площади стандартного раствора КФ по формуле:
Cx = Sx∙Co
So
где Cх – концентрация КФ в культуральной жидкости; Сo– концентрация КФ в стандартном растворе; Sх– площадь хроматографического пика КФ в культуральной жидкости,Auмкл; So– площадь хроматографического пика КФ в стандартном растворе, Auмкл.
Таблица 1.
Изменение содержания кодеина фосфата в процессе биодеструкции клетками R. rhodochrous ИЭГМ 647
| №
опыта |
Содержание кодеина фосфата, % | ||||||||
| 0
сут |
10
сут |
20
сут |
40
сут |
60
сут |
80
сут |
90
сут |
92
сут |
||
| Абиотич.
контроль |
99,70
±1,45 |
99,81
±1,60 |
99,82
±1,45 |
99,78
±1,20 |
99,80
±1,30 |
99,79
±1,25 |
99,80
±1,30 |
99,69
±1,90 |
|
| 1 | 99,61
±1,10 |
80,81±1,60 | 75,11± 1,71 | 68,37±1,42 | 60,02±1,00 | 42,87±1,45 | 41,82±1,30 | 40,77±1,21 | |
| 2 | 99,60
±1,30 |
84,10±1,20 | 70,72±1,45 | 60,30±1,77 | 8,20
±1,35 |
3,25
±1,45 |
1,01
±1,11 |
0 | |
Примечание: абиотический контроль – стерильный раствор КФ в фосфатном буферном растворе; опыт 1 – фосфатный буферный раствор + R. rhodochrous ИЭГМ 647 + 0,0002 г сульфата железа (II) (дробное внесение кодеина); опыт 2 – фосфатный буферный раствор + R rhodochrous ИЭГМ 647 (дробное внесение кодеина и культуры).
Таким образом, разработанные условия хроматографического определения КФ позволяют контролировать его содержание в культуральной жидкости родококков в процессе биодеструкции КФ.
Список литературы:
- Nikolau A. Pharmaceuticals and related compounds as emerging pollutants in water: analytical aspects / Global NEST Journal. – 2013. – V. 15. – No 1. – P. 1–12.
- Wick A. Elucidation of the transformation pathway of the opium alkaloid codeine in biological wastewater treatment / A. Wick, M. Wagner, T.A. Ternes // Environmental Science & Technology. – 2011. – V.45. – P. 3374 – 3385.
- Catalogue of Strains Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. List of Species and of IEGM Collection. 2014 [Электронный ресурс] URL: https://www.iegm.ru/iegmcol/strains/ (дата обращения 25.12.2014).[schema type=»book» name=»ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОДЕИНА ФОСФАТА В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЯХ РОДОКОККОВ» author=»Плотников Александр Николаевич» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-06-16″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)» ebook=»yes» ]