Установлено, что последовательность Pro-Arg на С-конце природного лиганда крови – тетрапептида тафцина (Thr-Lys-Pro-Arg) обусловливает его антиполимеризационное действие в отношении фибрин-мономера [1] и способствует повышению антикоагулянтной активности плазмы крови [7]. Препарат Селанк (Н-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH) – синтетический аналог природного тафцина с присоединенным трипептидом Pro-Gly-Pro обладает анксиолитическим действием и используется в основном при терапии генерализованного тревожного расстройства и неврастении [2]. Показано его ингибирующее действие на процессы гемостаза [11]. Синтетический препарат Семакс (H-Met-Gly-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH), также имеющий в своей структуре Pro-Gly-Pro, применяется в клинике в качестве ноотропного, нейропротективного и противоинсультного средства, поскольку он нормализует кровообращение мозга. В организме Семакс активирует противосвертывающую систему, повышая антикоагулянтную и фибринолитическую активность крови и снижая агрегацию тромбоцитов [9]. Эти эффекты, однако, не проявляются в условиях in vitro, что связано с опосредованным действием препаратов на гемостаз.
Установлено, что каждый из пептидов способен действовать в кровотоке как самостоятельно, так и через взаимодействие с антикоагулянтом крови гепарином [4]. Одним из доказательств взаимодействия олигопептидов с гепарином служат экспериментальные данные, свидетельствующие о снижении уровня гепарина после появления в крови этих пептидов [3].
Спектр физиологического действия гепарина широк: он обладает антикоагулянтным, антилипемическим, нейропротективным и другими свойствами [4]. Благодаря своим структурным особенностям он способен образовывать комплексы со многими веществами. Комплексные соединения гепарина с тромбогенными белками крови участвуют в регуляции жидкого состояния крови. Прочная связь гепарина и белка при этом обусловлена соединением сульфатных и карбоксильных групп полисахарида гепарина с NH-группами аргинина белка . Введение животным комплексных соединений высокомолекулярного гепарина с аминокислотами приводило к повышению антикоагулянтной активности крови [6].
Цель исследования заключалась в создании эффективных комплексов гепарина с глипролинами – Семаксом и тафцином с добавленным трипептидом Pro-Gly-Pro и сравнительном изучении их влияния на первичный и плазменный гемостаз, особенно на антикоагулянтную активность плазмы крови крыс в условиях in vitro и in vivo.
В данной работе использованы коммерческие препараты Семакса, тафцина, пептида Pro-Gly-Pro (Россия), гепаринa (“Serva”, США). Применяли стандартные коагулологические и биохимические методы исследования [5].
Получали смесь тафцина с пептидом Pro-Gly-Pro при молярном соотношении 1:1. Эта смесь была сходна по структуре с Селанком. Факт комплексообразования между гепарином и олигопептидами – тафцином+Pro-Gly-Pro (ТафPGP) и Семаксом (MGHFPGP) был доказан методами перекрестного электрофореза.
Проводилось исследование полученных нами комплексных соединений гепарина с TафPGP и MGHFPGP в условиях in vitro при разных молярных соотношениях компонентов, равных 1:6, 1:3, 1:1, 3:1, 6:1 .
Результаты экспериментов in vitro. Влияние комплексных соединений гепарина с олигопептидами на показатели гемостаза.
Установлено, что наибольшей антикоагулянтной активностью обладали комплексы MGHFPGP-гепарин и TафPGP–гепарин при соотношении, равном 1:1. Их антикоагулянтные свойства превосходили те же активности контрольных растворов гепарина. Комплексы, полученные при соотношениях пептид-гепарин, равных 3:1, 6:1 практически не обладали антикоагулянтными свойствами. Все исследованные комплексы пептидов с гепарином обнаруживали фибриндеполимеризационную активность, которая была максимальна для комплексов с соотношением компонентов 1:1.
В этих условиях установлено, что комплексные пептидные соединения с гепарином при концентрациях в плазменной среде от 10-1 до 10-4 мг/мл способны проявлять антикоагулянтную активность, повышая ее на 20–40% по сравнению с контрольным раствором NaCl. Кроме того, в более широком интервале концентраций от 10-1 до 10-7 мг/мл все исследованные комплексы гепарина c олигопептидами обладали фибриндеполимеризационной активностью, т.е. способностью растворять нестабилизированный фибрин даже в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза (Σ-аминокапроновой кислоты, антиплазмина). Эта активность комплексов превышала таковую эквивалентных концентраций пептидов на 40-48 %. В пределах концентраций комплексов гепарина с глипролинами от 10-1 до 10-9 мг/мл агрегация тромбоцитов снижалась на 25–38 %. Значительное снижение агрегации тромбоцитов до 38% наблюдалось под влиянием комплекса TафPGP с гепарином при его концентрациях в системе от 10-4 до 10-6 мг/мл. Следует отметить, что составные части комплексов не вызывали заметного изменения агрегации тромбоцитов.
Таким образом, в условиях in vitro комплексы гепарина с олигопептидами обладали антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной и антитромбоцитарной активностью, превышающей таковые активности эквивалентных концентраций составляющих компонентов. Комплекс TафPGP–гепарин по сравнению с комплексом Семакс-гепарин обладал наибольшей антитромбоцитарной активностью.
Результаты экспериментов in vivo
В экспериментах на животных использовались комплексные соединения гепарина с препаратами глипролинов – TафPGP и MGHFPGP при наиболее оптимальном молярном соотношении их компонентов, равном 1:1.
При внутривенном введении исследуемых комплексов пептидов с гепарином в дозе 1 мг/кг массы тела крыс наблюдался стабильный противосвертывающий эффект, превосходящий действие одного гепарина в эквивалентной дозе. А именно, антикоагулянтная активность комплексов пептидов с гепарином значительно превышала ту же активность отдельных пептидов и превосходила активность эквивалентной дозы гепарина. Фибринолитические свойства плазмы крови крыс после введения комплексов значительно превышали то же действие отдельных пептидов. Также было установлено, что после введения комплексов гепарина с пептидами усиливается антитромбоцитарная активность в плазме крови подопытных животных (табл.1).
Таким образом, впервые установленный факт значительного снижения агрегации тромбоцитов под воздействием указанных комплексов свидетельствовал о наличии у них антитромботической активности и улучшения реологических свойств крови.
Таблица 1.
Антикоагулянтная активность (по тесту АЧТВ), фибринолитическая активность (суммарная — СФА, неферментативная –НФ) и агрегация тромбоцитов (АТ) в плазме крови крыс после внутривенного введения препаратов комплекса тафцин+Pro—Gly—Pro–гепарин– (ТафPGPГ), Семакс-гепарин (СГ) в дозах 1 мг/кг массы тела и их составных частей в эквивалентных дозах (М±m)
|
Вводимые препараты |
CФА, мм2 | НФ, мм2 | АЧТВ, с |
АТ,% |
| Гепарин
Комплекс ТафPGPГ Комплекс CГ Тафцин+ PGP Семакс Контроль 0.85%-ный NaCl |
64.4 ± 0.4
81.0 ± 6.1** 84.7 ± 7.4** 43.1±1.7* 40.9 ± 1.1* 36.7 ± 0.9 |
34.9 ± 2.5
43.0 ±3.3** 49.5 ±5.3** 29.9±1.1* 27.2± 3.1* 24.4 ± 1.3 |
65.9 ± 8.7*
119.8±2.2** 103.6± 6.4** 39.9 ± 2.9* 41.3± 2.1* 34.4 ± 1.7 |
99.4 ± 6.4
61.7 ±7.7** 74.8 ±4.4** 94.0 ±2.9 90.0 ± 4.4 100.0 ± 4.4 |
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с 0.85%-ным NaCl.
Обозначения: * p < 0.05,**р<0.01
Проведенное исследование противосвертывающих свойств комплексных соединений гепарина с нейротропными пролинсодержащими пептидами (природным тафцином +PGP) и синтетическим Семаксом показало сходство в их противосвертывающем действии. По-видимому, наличие активных пептидных группировок Pro-Gly-Pro в глипролинах или Pro-Arg в тафцине при взаимодействии с гепарином способствует проявлению не только антикоагулянтного эффекта [8,10], но и фибринолитического действия в кровотоке. В то же время антикоагулянтная, фибриндеполимеризационная, антитромбоцитарная активности комплексов с гепарином превышали те же свойства пептидов, являющихся компонентами комплексов, что обусловлено структурными особенностями новых соединений – комплексов пептидов с гепарином. Как пептиды, так и их комплексы при появлении в крови вызывают выброс из эндотелия сосудов тканевого активатора плазминогена, который и приводит к повышению ферментативных фибринолитических свойств плазмы крови, включенных в суммарный фибринолиз, причем комплексы – в большей степени. Известно, что один гепарин также обладает подобным действием. На основании этих фактов можно утверждать, что пептиды в организме способны проявлять свой высокий противосвертывающий эффект через комплексообразование с гепарином. Показано, что комплексные соединения гепарина с пептидами при введении в организм усиливают не только антикоагулянтные, но и фибриндеполимеризационные, и антитромбоцитарные свойства плазмы крови, хотя один гепарин не обнаруживает подобного действия на полимеризацию фибрина и агрегацию тромбоцитов.
Установлено также, что при внутривенном введении препаратов комплексов наибольшим антикоагулянтным действием обладал комплекс ТафPGP–гепарин, наибольшим фибриндеполимеризационным – комплекс Семакс-гепарин.
Исследованные нами препараты комплексов имеют значительное преимущество перед известными лекарственными средствами, так как обладают сочетанным широким спектром не только противосвертывающих свойств – антикоагулянтным, фибринолитичекским , антитромбоцитарным и антитромботическим, но и ноотропными (глипролины, Семакс) и, как и тафцин, иммуномодулирующими активностями.
Заключение
На основании проведенного исследования можно говорить о перспективности использования комплексов гепарина с олигопептидом Семаксом, иммуномодулирующим пептидом тафцином с добавленным трипептидом Pro-Gly-Pro в качестве антикоагулянтно-фибринолитических и антитромбоцитарных препаратов не только для профилактики, но и для лечения тромбоопасных ситуаций. Эти комплексы препятствуют образованию фибрина благодаря наличию у них фибриндеполимеризационной активности и предупреждают процессы агрегации тромбоцитов вследствие наличия у них антитромбоцитарной активности. Проявление значительных антикоагулянтных эффектов комплексными соединениями гепарина с пептидами обусловлено их ингибирующим действием на активность тромбина. Значительным фибринолитическим действием в организме обладал комплекс Семакс-гепарин.
Список литературы
1.Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Черкасова К.А., Ашмарин И.П Пептиды как ингибиторы свертывающей активности тромбина и агрегации тромбоцитов // Успехи физиологических наук, изд-во Наука (М.), 1999 – Т. 30. – № 2. – С. 80– 91.
2.Зозуля А.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., и др. Ингибирующий эффект Селанка на активность энкефалиндеградирующих ферментов как один из возможных механизмов его анксиолитического дейстьвия // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2001– Т.131. – № 4. – С. 376– 378.
3.Оберган Т.Ю. Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма: . дис… канд. биол. наук. М.: 2004. – 225 с.
4.Кондашевская М.В. Морфофункциональные и психофизиологические эффекты высокомолекулярного гепарина (экспериментальное исследование). Автореферат докт.дисс. М.: 2006. – 47 с.
5.Ляпина Л.А., Григорьева М.Е., Оберган Т.Ю., Шубина Т.А. Теоретические и практические вопросы изучения функционального состояния противосвертывающей системы крови. М.: Адвансед Солюшнз, 2012. – 160 с.
6.Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Пасторова В.Е. Регуляторная роль соединений гепарина с низкомолекулярными лигандами крови в плазменном и тромбоцитарном гемостазе Известия Российской академии наук. Серия биологическая, издательство Наука (М.), 2011. – № 2. – С .208– 219.
7.Ahmed A., Wernock M., Nieman M., Srikanth S., Mahdi F., Krishnan R., Tulinsky A., Schmaier A. Mechanisms of Arg-Pro-Gly-Phe inhibition of thrombin // J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , 2003. – V. 285. – P.183–193.
8.Andreeva L.A., Myasoedov N.F., Lyapina L.A., Grigor’eva M.E., Obergan T.Yu, Shubina T.A. Effect of the PRO-GLY-PRO Peptide on Hemostasis and Lipid Metabolism in Rats with Hypercholesterolemia // Doklady Biological Sciences, издательство Maik Nauka/Interperiodica Publishing (Russian Federation), 2013. – V.453. – P. 333-335.
9.Grigorjeva M.E., Lyapina L.A. Anticoagulant and fibrinolytic effects of glyprolines in conditions of immobilization stress// Bulletin of Experimental Biology and Medicine, издательство Kluwer Academic Publishers (Netherlands)., 2011. – V. 149. – № 1. – P. 44-46.
10.Lyapina L.A., Grigorieva M.E., Obergan T.Yu, Shubina T.A., Andreeva L.A., Myasoedov N.F. Peptide regulation of metabolic processes under hypercholesterinemia conditions of an organism //Biology Bulletin, изд-во Maik Nauka — Interperiodica (Russian Federation), 2015. – V.42.– № 6. – P. 546– 555.
11.Myasoedov N.F., Andreeva L.A., Grigorjeva M.E., Obergan T.Y., Shubina T.A., Lyapina L.A. The influence of Selank on the parameters of the hemostasis system, lipid profile and blood sugar level// Doklady Biological Sciences, изд-во Maik Nauka/Interperiodica Publishing (Russian Federation), 2014. – V.458 – № 1. – P. 267–270 .[schema type=»book» name=»УСИЛЕНИЕ ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ ПЕПТИДОВ СЕМАКСА, ТАФЦИНА C PRO-GLY-PRO ПУТЕМ ИХ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ С ГЕПАРИНОМ» description=»Цель – повысить антикоагулянтную активность пептидов семакса и тафцина с Pro-Gly-Pro. Использованы современные коагулологические методы исследования. Показано повышение антикоагулянтного действия пептидов вcледствие создания их соединений с гепарином; продемонстрированы их защитные противосвертывающие эффекты на систему гемостаза в условиях in vitro и при внутривенном введении в организм здоровых животных (крыс). Делается вывод о способности комплексов олигопептидов с гепарином предупреждать процессы тромбообразования в организме при их угрозе. » author=»Ляпина Людмила Анисимовна, Григорьева Марина Евгеньевна, Оберган Тамара Юрьевна, Майстренко Евгения Семеновна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2016-12-23″ edition=»euroasian-science.ru_25-26.03.2016_3(24)» ebook=»yes» ]