СТИМУЛЯЦИЯ ДЫХАНИЯ И РАБОТЫ СЕРДЦА У КРЫС ПРИ ГЛУБОКОЙ ГИПОТЕРМИИ

В последнее время в связи с освоением Арктики становятся все более актуальными исследования по выяснению пределов холодоустойчивости человека и разработки эффективных способов реанимации охлажденного организма, когда практически отсутствует пульс, но надежда на спасение еще остается. Отогревание человека, находящегося в состоянии глубокой гипотермии, без предварительной стимуляции дыхания и деятельности сердца, как правило, не дает положительного эффекта [3, 8]. Однако в природе мы имеем примеры животных (зимоспящие), которые способны переносить значительное понижение температуры тела во время зимней спячки и довольно быстро возвращаться в состояние нормотермии [4, 5]. Поэтому представляется чрезвычайно актуальным проведение исследований по восстановлению дыхания и работы сердца у гомойотермного организма при глубокой гипотермии без применения отогревания. После полной остановки дыхания при охлаждении организма сердце продолжает еще работать в течение 15-20 минут, но потом из-за недостатка кислорода прекращает работу. Попытки отогревания лишь увеличиваются потребности организма в энергии, которые вследствие отсутствия  дыхания и слабой работы сердца невозможно удовлетворить.

Известно, что охлаждение тела угнетает деятельность АТФазы – фермента участвующего в синтезе АТФ, недостаток АТФ ведет к недостатку энергии, что тормозит процесс выведения из клетки избытка ионов кальция [6, 7]. В результате повышается концентрация ионов кальция выше базового уровня, что нарушает функции клеток дыхательного центра и вызывает его паралич. Одним из способов замедлить развитие холодового стресса клеток и снизить температуру наступления холодового паралича дыхательного центра у гомойотермного организма может быть снижение концентрации Са²⁺ в крови [1, 2]. Ранее нами было показано, что уменьшение концентрации Са²⁺ в крови на 20-30% с помощью Na₂ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) у животных при температуре тела 25-22ºС, вызывает повышение интенсивности холодовой мышечной дрожи, частоты и амплитуды дыхания [1, 3].

Цель данного исследований — разработка методов сохранения жизнеспособности гомойотермного организма при глубокой гипотермии после холодового паралича дыхательной функции и нарушений работы сердца, без применения отогревания.

Методика

Опыты проводились на  белых крысах-самцах линии Вистар массой 280–320 г. После наркотизации (уретан, 125 мг/на 100 г, внутрибрюшинно) животные укреплялись на специальном станке. В бедренные вену и артерию вводились полиэтиленовые катетеры для инъекций и измерения кровяного давления. Измерение температуры в прямой кишке (на глубине 4.5 см) и в области продолговатого мозга производили с помощью медно-константановых термопар. Через 2-2.5 часа после операции крыс опускали в воду с температурой  8=10^оС. При этом голова животных находилась над уровнем воды. В опытах регистрировались пневмограмма, электрокардиограмма (ЭКГ), кровяное давление в бедренной артерии, температура тела в прямой кишке и в мозге. В опытах с использованием аппарата искусственной вентиляции легких на передней лапке крысы (шерсть удаляли депиляторием) укреплялся датчик пульсоксиметра. После остановки дыхания животное извлекалось из воды. Через 5-6 минут после извлечения из воды животным опытной группы (n=6) через бедренную вену медленно (за 4 мин) в кровь вводился 1 мл 0.5% раствора Na₂ЭДТА. Это вещество образует комплексное соединение с ионами кальция и понижает таким образом, содержание Са²⁺ в крови. Концентрация ионов кальция в цельной крови (пробы по 0.3 мл) определялась методом прямой потенциометрии пленочными кальций-селективными электродами. В других сериях опытов крысам (также через 2-3 мин после извлечения из воды) в течение 3х минут вводили 4 мл полиглюкина (кровезаменитель, 6% раствор декстрана). Кроме того, применялось последовательное введение обоих препаратов. В экспериментах с искусственной вентиляцией легких канюля, введенная в трахею, после остановки собственного дыхания подключалась к аппарату искусственной вентиляции легких. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica.

 

Результаты исследований и их обсуждение

До охлаждения у крыс ректальная температура была в диапазоне 36.5-37^оС, температура мозга 35.5-36.5^оС, частота дыхания 85-104 циклов/мин, частота сердцебиений 460-480 ударов/мин, кровяное давление на уровне 90-115 мм рт.ст., [Ca²⁺] – 1.03±0.02 ммоль/л. Время охлаждения крыс составляло примерно 60-70 мин. Остановка дыхания происходила при температуре в прямой кишке 14.5±0.5^о, в мозге 15.9±0.3^оС. К моменту остановки дыхания частота сокращений сердца у животных уменьшалась от 478±8 до 43±7 ударов/мин, артериальное кровяное давление было 30–50 мм рт.ст.

1. Внутривенное введение Na₂ЭДТА.

Перед введением крысам Na₂ЭДТА температура в прямой кишке была 13.1±0.5^о и в мозге 15.0±0.3^оС. Через 8 мин после остановки дыхания и  инъекции Na₂ЭДТА содержание Са²⁺ в крови группы опытных крыс снизилось от 1.21±0.03 ммоль/л (измерение производилось до введения препарата) до 0.87±0.05 ммоль/л p_w< 0.01), т.е. на 28%. У всех крыс появилось редкое дыхание (таблица 1). При этом температура мозга и в прямой кишке была ниже, чем при остановке дыхания (p_w< 0.05). Латентное время появления дыхательных движений в ответ на внутривенное введение Na₂ЭДТА было в среднем 4.2±1.3 мин, а поскольку дыхание отсутствовало у крыс некоторое время до введения препарата (9.3±1.4 мин), то общее время отсутствия дыхательных движений составило в среднем 13.5±2.6 мин.

Таблица 1.

Физиологические параметры крыс после введения Na₂ЭДТА (n=6)

Время от начала введения Na2ЭДТА, Мин	Ректаль- ная тем- пература, оС	Темпера-тура мозга, оС	Артери-альное давление, мм рт.ст.	Частота дыхания, циклов/ мин	Частота сердечных сокраще- ний, ударов/мин	[Ca2+] в крови, ммоль/л
8	12,8±0,5	14,8±0,3	28±5	5±2	40±4	0,87±0,05
20	12,3±0,6	14,7±0,4	35±3	7±1	45±5
40	12,4±0,7	14,8±0,4	33±3	10±2	49±4
60	12,2±0,7	14,9±0,3	43±6	12±3	57±7	1,07±0,04

2. Сравнение эффектов от введения Na_2·ЭДТА и полиглюкина

Было проведено 3 опытных серии опытов и одна контрольная. В первой серии через 2-3 мин после остановки дыхания и извлечения крыс из воды в бедренную вену за 4 минуты вводили 1 мл 0.5% раствора Na_2·ЭДТА. Во второй серии крысам (также через 2-3 мин после извлечения из воды) в течение 3х минут вводили 4 мл полиглюкина (кровезаменитель, 6% раствор декстрана). А в третьей серии вводили оба препарата: сначала полиглюкин и через 2 мин Na_2·ЭДТА. Температура растворов была 15-16ºС. Контрольным животным после остановки дыхания и извлечения их из воды ничего не вводили. В таблице 2 приведены значения температуры в прямой кишке и в мозге для трех опытных групп животных, измеренные за 30 мин до извлечения крыс из воды, при остановке дыхания, а также через 30, 60 и 90 мин после извлечения из воды.

Таблица 2.

Изменение ректальной температуры и температуры мозга у крыс опытных серий №1 (Na_2·ЭДТА, n=8), №2 (полиглюкин, n=5) и №3 (полиглюкин и Na_2·ЭДТА, n=8) до и после остановки дыхания при глубокой гипотермии.

Название серии	Температура, С°	За 30 мин до извле-чения крыс из воды	Остановка дыхания, извлечение из воды	Время после извлечения крыс из воды
				30 мин	60 мин	90 мин
Серия 1 Na2·ЭДТА	Тр	19.7±0.5	15.0±0.2	14.3±0.2	14.4±0.2	14.4±0.2
	Тм	22.1±0.7	16.3±0.1	15.7±0.2	16.2±0.2	16.6±0.1
Серия 2 полиглюкин	Тр	20.6±0.9	15.6±0.4	14.2±0.4	13.8±0.5	13.4±0.4
	Тм	23.2±0.7	17.7±0.2	16.5±0.3	16.0±0.3	16.0±0.2
Серия 3 полиглюкин, Na2·ЭДТА	Тр	19.9±0.8	15.9±0.6	14.3±0.5	14.1±0.4	13.9±0.4
	Тм	23.4±0.5	18.0±0.4	16.4±0.2	16.3±0.2	16.1±0.1

Эффект возобновления дыхания наблюдался как в опытах с введением одного полиглюкина, так и в опытах с совместным введением полиглюкина и Na₂ЭДТА. Важно подчеркнуть, что частота дыхания у крыс, которым вводили Na₂ЭДТА, повышалась до более высоких значений (25-30 циклов/мин), чем у крыс, которым вводили только полиглюкин (5-12 циклов/мин). В группе крыс (n=8), где последовательно вводили 4 мл полиглюкина (за 3 мин), и еще через 2 мин вводили 1 мл 0.5% раствор Na_2·ЭДТА (за 4 мин) ЧД через 10 мин от момента извлечения из воды была 10.3±1.4 циклов/мин. Через 1.5 часа ЧД возросла до 25.3±3.6 циклов/мин, АД 64.9±5.1 мм рт.ст., ЧСС 66.3±3.0 ударов/мин. Изменения частоты сердечных сокращений в трех группах достоверно не различались.

2. Применение искусственной вентиляции легких для активизации работы сердца

С целью изучения влияния гипоксического фактора на работу сердца при глубокой гипотермии были проведены исследования с применением искусственной вентиляции легких, которая начиналась через 1-2 минуты после прекращения собственного дыхания. В этих опытах крыс из воды не извлекали.

В трахею на предварительной операции была введена канюля, которая подсоединялась к аппарату искусственной вентиляции легких. Подключение к аппарату производили через 1-2 мин после остановки собственного дыхания, когда уже начались нарушения в работе сердца (резкое снижение частоты сердцебиений, нарушение ритма. Уже примерно через 2-3 минуты восстанавливалась ритмичная работа сердца, возрастала частота сердечных сокращений. При этом по показаниям пульсоксиметра насыщение гемоглобина кислородом дартериальной крови достигало уровня 94-96%. Данные этих экспериментов представлены в таблице 3. У контрольных крыс после остановки дыхания через 15-20 минут кровяное давление падало до нуля, и сердце прекращало работу. Искусственная вентиляция легких после наступления холодового паралича дыхательного центра значительно отодвигает порог остановки работы сердца и по времени, и по температуре. до ректальной температуры 10,0±0.2º и в мозге 13.3±01º.

Заключение

В экспериментах на крысах получены данные, что с помощью внутривенного введения Na_2·ЭДТА при глубокой гипотермии можно восстанавливать дыхание без специального согревания животного. Показано, что введение полиглюкина после остановки дыхания обеспечивает поддержание более высокого уровня артериального давления, чем в опытах, где вводили только Na_2·ЭДТА. Введение в кровяное русло полиглюкина может быть фактором, стабилизирующим работу сердца при глубокой гипотермии и повышающим вероятность выживания крыс.

Таблица 3.

Активизация работы сердца крыс с помощью искусственной вентиляции легких при глубокой гипотермии (n=10)

Периоды опыта	Температура, ºС			Частота дыхания, цикл/мин	Частота сердечных сокращений, уд/мин	Артериальное давление, мм рт. ст.	SpO2, %
	Ректум	пищевод	Мозг
Исходное состояние	33,9±0,2	33,5±0,1	32,8±0,1	97±6	407±8	88±2	97±0,6
Охлаждение в воде 8-10ºС: А) Остановка дыхания	16,2±0,6	17,5±0,7	18,7±0,6	0	23±1	20±2	—
Б) Искусствен-ное дыхание, 2-я мин	15,2±0,4	16,7±0,5	18,0±0,5	14±1	59±5	42±4	90±3
В) Искусствен-ное дыхание, 10-я мин	14,1±0,3	15,6±0,4	17,0±0,4	14±1	60±4	39±2	94±2
Г) Искусствен-ное дыхание, 60-я мин	11,2±0,3	12,9±0,2	14,2±0,2	14±1	38±2	26±2	84±3
Д) 85±6 мин от остановки дыхания	10±0,2	12±0,2	13,3±0,1	14±1	19±2	0	—

SpO₂% – насыщение кислородом гемоглобина артериальной крови

Важно отметить, что в группе крыс, которым вводили только полиглюкин, не наблюдалось повышения частоты дыхания выше 10-12 циклов/мин, что в 2-3 раза меньше, чем активизация дыхания после введения Na_2·ЭДТА. Это свидетельствует о том, что именно снижение концентрации ионов кальция в крови (на 20-30%) стимулирует рост частоты дыхания при гипотермии. В экспериментах с подключением искусственной вентиляции легких (после холодового паралича собственного дыхания) было показано, что остановка сердца крыс может быть предотвращена за счет применения искусственной вентиляции легких, с частотой 14-16 циклов в мин. Таким образом, у крыс, находящихся в воде при 8-10°С, удалось на 1.5-2.5 часа восстановить работу сердца и на 5-6°С снизить температурный порог прекращения работы сердца. Следовательно, остановка сердца, происходящая непосредственно за остановкой дыхания, обусловлена недостатком кислородного снабжения сердечной мышцы. А более низкие значения температурных пределов работы сердца, которые были достигнуты в наших экспериментах, могут отражать истинные температурные пороги функционирования сердца крыс. Возможно, что дальнейшие исследования позволят их еще более понизить.

При реанимации жертв эксидентальной гипотермии обычно применяют отогревание организма. Однако, согревание организма, находящегося в состоянии глубокой гипотермии, чревато отрицательными последствиями, так как в условиях недостаточного энергоснабжения тканей и органов оно может ускорить гибель, поэтому метод реанимации без согревания может иметь свои преимущества. Результаты данных экспериментов могут быть использованы в реанимационной практике; предлагаемые нами препараты могут применяться для восстановления дыхания без отогревания тела.

Список литературы:

1. Арокина Н.К. Стимуляция кожных терморецепторов и холодовой дрожи с помощью инъекций ЭДТА при глубокой гипотермии // Сенсорные системы. 2002. Т.16. № 3. С. 238 — 244.
2. О возможном участии ионного стресса в холодовой гибели клеток / К. Б. Асланиди, Г. В. Асланиди, Д. М. Вачадзе, В. П. Зинченко, Ю. А. и др. // Биологические мембраны. 1997. Т.14. №1. С. 50-64.
3. Иванов К.П. Проблема восстановления физиологических функций у человека при глубокой эксидентальной гипотермии (к вопросу о пределах физиологической адаптации) // Физиология человека. 2002. Т. 28. №3. С. 123-130.
4. Крамарова Л.И., Зиганшин Р.Х., Гахова Э.Н. Эндогенные гипометаболические-гипотермические факторы и их возможное применение для жизни в холоде // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35. №5. С. 597-609.
5. Boutilier R.G. Mechanisms of cell survival in hypoxia and hypothermia // J.exper. biol. 2001. – V. 204. pt 18. P. 3171-3181.
6. Carafoli E. The calcium pumping ATPase of the plasma membrane // Ann. Rev. Physiol. 1991. V.53. P. 531-547.
7. Hochachka P.W., Somero G.N. Strategies of biochemikal adaptation. London: W.B. Sanders Company, 1973.
8. Kempainen R.R., Brunette D.D The evaluation and management of accidental hypothermia // Respir. Care. 2004. V. 49. № 2. С. 192-205.[schema type=»book» name=»СТИМУЛЯЦИЯ ДЫХАНИЯ И РАБОТЫ СЕРДЦА У КРЫС ПРИ ГЛУБОКОЙ ГИПОТЕРМИИ» author=»Арокина Надежда Константиновна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-05-05″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 28.02.2015_02(11)» ebook=»yes» ]