ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ПОВИЛИКИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ.

В последние годы возрос интерес исследователей к растениям-паразитам в составе которых определены различные цитотоксины [1]. Наиболее изучены цитотоксины белковой природы активно подавляющие рост раковых клеток в культуре тканей, что во многом стимулирует исследователей к поиску новых источников их выделения [2,3].

Одним из малоизученных объектов являются лектиноподобные белки паразитирующих растений. Интерес к растениям паразитам рода Cuscuta объясняется тем, что они используются для лечения различных форм опухолей [4]. С другой стороны в последние годы появилось ряд сообщений по выделению и характеристики белков, а также активного химического начала из кускуты, названный авторами кускутные кислоты – А и Д, обнаружены противоопухолевые вещества гликозидподобной природы [1, 5, 6].

Ранее нами была изучена канцеролитическая активность различных видов повилики, произрастающих в Центральной Азии. Получены экстракты из трех видов: Cuscuta europea, Cuscuta lupuliformis, Cuscuta attenuate, паразитирующих соответственно на луговых травах, на побегах ивы и на фруктовых кустарниках. Установлено, что экстракты разных видов повилики оказались цитотоксичными в культуре тканей (от 40-80% подавления роста опухолевых клеток меланомы – рак кожи) [7]

Целью данной работы является изучение цитотоксической активности лектиноподобных гликопротеидов повилики.

В качестве растительного сырья использовали семена повилики (Cuscuta europea) произрастающие на луговых травах. Лектиноподобные белки (ЛПБ) были выделены из семян повилики путем экстракции солевым раствором с последующим ступенчатым высаливанием сульфатом аммония.

Для этого сухое сырье измельчали и переносили в фосфатно солевой буфер (ФСБ), содержащий 0,14 М NaCl, рН 7.7. Экстрагировали 2 ч на магнитной мешалке. Экстракт центрифугировали и собранные после центрифугирования супернатант (суммарные белки) подвергали ступенчатому высаливанию сульфатом аммония: одну часть осаждали сульфатом аммония до конечной концентрации 20% и вторую часть – до 50%. Центрифугировали и полученные супернатанты, обозначенные нами С₂₀ и С₅₀ и осадки – ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀, диализовали против дистиллированной воды. Содержание белка определяли по методу Лоури [8]. Содержание углеводов определяли антрон-сернокислотным методом. [9]. Гемагглютинирующую активность ЛПБ определяли с использованием 2% суспензии крови человека или кролика в 96U – образных иммунологических планшетах [10].

Установлено, что наибольшую гемагглютинирующую активность проявляли фракции ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀. Углеводную специфичность определяли, как описано в работе Поспелова [10]. Показано, что специфичность к глюкозе и маннозе проявила фракция ЛПБ₅₀.

Ранее нами показано цитотоксическое действие белков ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀ на клетках Hela и В-16 [11].

В данной работе изучена цитотоксическая активность на клетках U₉₃₇ и Акат.

Клеточная культура Акат выведена нами из перевиваемой опухоли Акатон (рак тонкой кишки мыши) для изучения биологически активных веществ, в том числе и противоопухолевых. Нами изучена чувствительность данной клеточной линии к действию некоторых клинических противоопухолевых препаратов разных классов: алкилирующие вещества (циклофосфан); антиметаболиты (метотрексат); противоопухолевые антибиотики (доксорубицин); вещества растительного происхождения (винбластин); синтетические противоопухолевые препараты – цисплатин.

Цитотоксический эффект препаратов оценивали МТТ — тестом. Для определения цитотоксического действия перевиваемую культуру клеток Акат рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 20-30 тыс. клеток/мл в 100 мкл среды RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбриона теленка и культивировали при температуре 37⁰С в СО₂ – инкубаторе. Через сутки вводили вещества в концентрациях 100, 10 и 1 мкг/мл на 100мкл среды, культивировали клетки в течение 24 часов и далее вводили в клетки МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид] для выявления живых клеток [12]. После часовой инкубации среду осторожно сливали, добавляли ДМСО и инкубировали 20 мин., затем измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 620нм.

Результаты исследования действия клинических противоопухолевых препаратов на клеточную линию Акат представлены в таблице 1.

                                                                                    Таблица 1

Действие клинических противоопухолевых препаратов на клетки АКАТ

Дозы   Препараты	Процент подавления роста клеток, дозы мкг/мл.
	100	10	1
Метотрексат	58	45	11
Винбластин	81	65	57
Доксорубицин	72	58	38
Циклофосфан	57	43	37
Цисплатин	96	82	63

Как следует из данных таблицы 1 стабильная клеточная линия АКАТ достаточно чувствительна к действию клинических препаратов различного механизма действия и может служит тест-системой для прескрининга широкого круга биологически активных веществ.

Цитотоксичность лектиноподобных белкв оценивали биохимически с помощью MTT-метода, подсчета живых клеток и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы [11,13]

Контролем служили клетки без воздействия веществ. Уровень активности ЛДГ в контрольных клетках брали 100%. Цисплатин взят нами в качестве положительного контроля, указывающего на чувствительность клеток к воздействию препаратов.

Данные, полученные на клетках U₉₃₇  представлены в таблице 2

Таблица 2

Действие гликопротеидов Cuscuta europea  на культуру клеток U₉₃₇

Доза, мкг/мкл   Образцы	Подавление включения МТТ в клетки, %			Подавление роста клеток, %			Активность ЛДГ, %
	100	10	1	100	10	1	100	10	1
∑ фракция	100,0	31,0	17,0	98,0	35,0	17,0	24,0	6,0	4,0
С20	48,0	49,0	51,0	50,0	43,0	51,0	19,0	5,0	3,8
С50	49,0	51,0	42,0	52,0	49,0	40,0	14,5	6,5	3,0
ЛПБ20	86,0	64	61	80,0	60,0	59,0	24,5	7,8	4,6
ЛПБ50	93	76	53	95,0	70,0	46,0	23,0	7,5	4,2,
Цисплатин	100,0	96,0	45,0	97	88	34	25,0	23,4	3,9

Как видно из таблицы 2 наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция и фракции ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀ — 100%, 86% и 93% при дозе белка 100 мкг/мл. Аналогичные результаты получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Нами также изучена цитотоксическая активность на культуре клеток Акат (Таблица 3).

Таблица 3

Действие гликопротеидов Cuscuta europea  на культуру клеток Акат.

Доза, мкг/мкл   Образцы,	Подавление включения МТТ в клетки, %			Подавление роста клеток, %			Активность ЛДГ, %
	100	10	1	100	10	1	100	10	1
∑ фракция	86,0	33,0	10,0	80,0	34,0	11,0	30,0	8,0	3,0
С20	35,0	15,0	8,0	33,0	17,0	5,0	26,0	5,0	4,0
С50	40,0	12,0	10,0	46,0	12,0	8,0	23,0	5,0	3,0
ЛПБ20	89,0	58,0	43,0	90,0	55,0	41,0	28,0	9,0	5,0
ЛПБ50	96,0	60,0	40,0	95,0	58,0	37,0	27,0	7,0	5,0
Цисплатин	98,0	85,0	35,0	97	59	34	26,0	22,0	5,0

Как видно из таблицы 3 фракции белков  Cuscuta europea оказывает различное воздействие. Так, цитотоксическое действие на клетки оказывает суммарная фракция белка и фракции, полученные осаждением сульфатом аммония 20% и 50% — 100%, 89% и 96% при дозе белка 100 мкг/мл, соответственно. А также 60% цитотоксичность проявили фракция ЛПБ₅₀ при дозе белка 10 мкг/мл. Аналогичные результаты подавления роста клеток получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ.

Таким образом, нами выделены и охарактеризованы лектиноподобные белки из повилики (Cuscuta europea).  Изучено цитотоксическая активность и установлено, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция лектиноподобных белков и фракции ЛПБ₂₀ и ЛПБ₅₀  по трем тестам, а именно по включению МТТ в клетки, по подсчету живых клеток и по уровню активности ЛДГ.

Список литературы

1. Du X-Mkohinata K., Kawasaki T., Guo Y-T., Miyahara K., Phytochemistry, 1998, v. 48, p. 843-850
2. . Lord J.M. The use of cytotoxic plant lectins in cancer therapy. // Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 1 -3.
3. Dwek B.A., Glycobiology: toward understanding the function of sugars // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 683-720
4. Федюшин М.П. Некоторые материалы к истории русской онкологии // Вопр. онкол., 1953, XXVI, 6, P. 278-287).
5. Аnis E. et. al.Sterols and Sterol Glycosides from Cuscuta reflexa // Natural Product Sciences, 1999, N. 5 P. 124-126
6. Zhelev ZH. D et. , Isolation , partial characterization and complement inhibiting activity of a new glycoprotein from cuscuta euroea // BBRC, 1994, V. 202, P. 186-194
7. Мавлонов Г.Т., Убайдуллаева Х.А. и др., Исследование антираковых компонентов повилики Cuscuta I. // Труды международной конф., 2004, Алматы, стр.201-203.
8. Lowry O., Rosenbroung R., Parr A., Randall R.I. Protein measuremen with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-269
9. Хашимова З.С., Мангутова Ю.С., Леонтьев В.Б. Структурно — функциональное изучение гликопротеидов хлопчатника // Химия природ. соедин. 1999. №. 3. С.376-384.
10. Поспелов С.В. Лектины представителей рода эхинацея (Echinacea mjench.). Методические аспекты оценки активности. // Химия растительного сырья 2012, № 3 С. 143-148
11. Кахарова К.А.,Хашимова З.С., Сагдиев Н.Ж. Гликопротеиды паразитирующих растений (Cuscuta Europea) // Труды межд. симпозиума Фундаментальные и прикладные проблемы науки,2014, т. 3, С. 122-128
12. Berridge MV, Herst PM , and Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005).
13. Бочкарев А.В., Зимин Ю.В., Хомутов А.Е. Изменение активности лактатдегидрогеназы печени крыс при действии гепарина в условиях in vitro // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2006, № 5, с. 86-88[schema type=»book» name=»ЛЕКТИНОПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ПОВИЛИКИ: ХАРАКТЕРИСТИКА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ.» description=»Целью данной работы является изучение цитотоксической активности лектиноподобных гликопротеидов повилики. Лектиноподобные белки (ЛПБ) были выделены из семян повилики путем экстракции солевым раствором с последующим ступенчатым высаливанием 20% и 50% сульфатом аммония и обозначены ЛПБ20 и ЛПБ50. Установлено, что наибольшую гемагглютинирующую активность проявляли фракции ЛПБ20 и ЛПБ50. В полученных нами фракциях изучена углеводная специфичность и показано, что специфичность к глюкозе и маннозе проявляет фракция ЛПБ50. Цитотоксичность ЛПБ оценивали биохимически на перевиваемых клеточных культурах U937 и Акат (выведеная нами новая стабильная клеточная линия из перевиваемой опухоли Акатон -рак тонкой кишки мыши),с помощью MTT-метода, подсчета живых клеток и по высвобождению из клеток лактатдегидрогеназы. На клеточной культуре U937 наибольшую цитотоксическую активность проявили суммарная фракция и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 — 100%, 86% и 93% при дозе белка 100 мкг/мл. На клетках Акат фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 также проявили высокую цитотоксическую активность. Аналогичные результаты подавления роста клеток получены при подсчете клеток трипановым синим и по определению уровня активности ЛДГ. Таким образом, нами выделены и охарактеризованы лектиноподобные белки из повилики (Cuscuta europea). Изучено цитотоксическая активность лектиноподобных гликопротеидов повилики. Установлено, что наибольшую цитотоксическую активность проявляют суммарная фракция лектиноподобных белков и фракции ЛПБ20 и ЛПБ50 по трем тестам, а именно по включению МТТ в клетки, по подсчету живых клеток и по уровню активности ЛДГ.» author=»Кахарова Камола А Азаматовна, Хашимова Зайнат Саттаровна, Сагдиев Наиль Жадитович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2016-12-23″ edition=»euroasian-science.ru_25-26.03.2016_3(24)» ebook=»yes» ]