ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ, ПРООКСИДАНТНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА

Злокачественные новообразования являются одной из основных жизнеугрожающих проблем во всём мире, а в развивающихся странах, таких как Россия, считаются второй по значимости причиной смертности среди населения, после заболеваний сердечно-сосудистой системы [1]. В структуре общемировой онкологической заболеваемости 4-е место среди злокачественных новообразований (ЗНО) занимает рак желудка (РЖ) составляя 16,1 на 100 тыс. населения, при этом более 90% всех ЗНО желудка составляют аденокарциномы. В Европе этот показатель составляет 23,9 на 100 тыс. населения, а в России — 25,0 на 100 тыс. населения, уступая лишь ЗНО легких, тем самым занимая 2-е место среди онкозаболеваний [2]. При этом пик заболеваемости РЖ приходится на возраст 65±5 лет, однако, в последние годы наметилась тенденция по существенному омоложению РЖ [3].

В большинстве стран мира, в том числе России, смертность от ЗНО желудка приближается к онкологической заболеваемости. При этом показатель смертности очень зависит от ранней диагностики онкозаболевания, возраста больных, клинической стадии, успеха лечения и, конечно же, понимания биологии опухолевого роста [4].

Патогенез изменений слизистой оболочки желудка, который может привести к развитию рака, является сложным и многофакторным процессом, поэтому изучение метаболизма ЗНО представляет значительный практический интерес, поскольку может служить мотивацией для углубления знаний о биологии опухоли, необходимых для своевременной диагностики и поиска новых мишеней для успешной терапии [5]. Для РЖ характерной биохимической чертой является стойкая гипоксия различной выраженности, сочетающейся с усиленной генерацией активных форм кислорода (АФК) [6].

Целью работы, стало сравнительное изучение изменений в работе прооксидантной системы (ПОС) и антиоксидантной системы (АОС), а так же их взаимосвязь с обменом пуриновых нуклеотидов в организме больных РЖ с различной стадией заболевания.

Нами была изучена активность ключевых ферментов распада пуриновых нуклеотидов — аденозиндезаминазы (АДА) и ксантиноксидазы (КО), которые оказывают существенное влияние на пул прооксидантов, нарабатывая АФК, а также активности ферментов первой линии антиоксидантного звена защиты от АФК:  супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГПО). Так же, мы исследовали уровень нитратов/нитритов (NO_х) – который является не только показателем метаболизма оксида азота (NO), обладающего свободнорадикальными свойствами, но и как установлено относительно недавно — важным его источником в клетках.  Значения этих показателей в гомогенатах тканей мы определяли для изучения статуса ПОС и АОС при РЖ.

Материалы и методы. Исследование изучаемых показателей проводили в гомогенатах тканей опухоли РЖ. В качестве контроля служила неизмененная ткань слизистой оболочки желудка – ткань края резекции, отдаленная от опухоли (min 30 мм от опухолевого инфильтрата) и не имеющая гистологических и морфологических признаков злокачественной трансформации. Материал для исследования был взят после радикальной операции. Обследовано 26 больных с аденокарциномой желудка в возрасте от 60 до 79 лет. Больные были разделены на две группы в зависимости от стадии РЖ: в 1-ю группу были включены 12 человек с I-II стадией заболевания, во 2-ю группу – 14 человек с  III-IV стадией рака. При проведение статистического анализа сравнения исследуемых показателей ПОС и АОС, достоверных отличий по гендерному признаку нами обнаружено не было, ни для одного из изученных показателей.

Активность АДА определяли по изменению оптической плотности реакционной смеси при длине волны 265 нм, обусловленном накоплением инозина при гидролитическом распаде аденозина [7]. Определение активности КО основано на способности фермента генерировать супероксиданион радикал, содержании которого судили по скорости восстановления нитросинего тетеразолия в формазан [8]. Активность СОД определяли по торможению аутоокисления адреналина, окисляющегося самопроизвольно в щелочной среде с образованием окрашенного соединения — адренохрома с пиком поглощения на 480 нм. Активность СОД выражалась в единицах активности на мг белка (ед/мг) [9]. Определение активности ГПО основано на измерении скорости окисления восстановленного глутатиона (GSH) в присутствии энзима и НАДФН регистрируемого спектрофотометрически по изменению оптической плотности среды в процессе реакции, 1 мкМ НАДФН соответствует 1 мкМ GSH. Активность выражалась в мкмоль/мин*мг [10]. Эндогенный уровень NO в форме нитрит-аниона (NO₂^—) после энзиматического восстановления нитратов в нитриты определяли с помощью  классической реакции Грисса и обозначали как NO_х [11].Определение общего белка проводили в соответствии с методикой описанной Лоури [12]. Определение всех исследуемых показателей проводились спектрофотометрически и регистрировались на спектрофотометре Specord-200. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы «Statistica 10.0» Statsoft. Для проверки распределения данных на нормальность использовался критерий W Шапиро-Уилка.

Исследование соответствует этическим принципам клинических испытаний и положениям Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации, не нарушает интересы пациента и не вредит его здоровью (Комиссия по биоэтике Донецкого национального медицинского университета им. М. Горького). Авторы сообщают (заявляют), что не имеют конкурирующих интересов.

Результаты и их обсуждение. При исследовании ферментативных и не ферментативных представителей ПОС и АОС у больных РЖ, нами были установлены статистически значимые изменения всех показателей в опухолевой ткани относительно слизистой, в зависимости от стадии патологического процесса.

Анализируя 1-ю группу установили следующие изменения в опухолевой ткани относительно ткани СОЖ: повышение активности АДА в 2,05 раза (р=0,0001), активность КО повышалась в 2,97 раза (р=0,0001), а так же увеличение уровня NO_x в 1,5 раза (р=0,0003). При этом обнаружено снижение активности СОД в 6,2 раза (р=0,0001) и активности ГПО в 1,5 раза (р=0,0001) в ткани опухоли относительно слизистой (Таблица 1).

Изучая 2-ю группу было установлено увеличение следующих показателей: повышение активности АДА в 1,8 раза (р=0,0001), КО в 3,3 раза (р=0,0001), СОД в 2,4 раза (р=0,0001), а так же уровня NO_x в 1,8 раза (р=0,0002) в ткани опухоли относительно слизистой. Активность ГПО, так же как и в 1группе была ниже в 1,5 раза в опухолевой ткани относительно СОЖ.

Таблица 1

Показатели прооксидантной и антиоксидантной систем в гомогенате тканей у больных РЖ в зависимости от стадии заболевания (М±σ)

Показатели	1-я гр. I-II стадия (n=12)		2-я гр. III-IV стадия (n=14)
	Ткань СОЖ	Опухолевая ткань	Ткань СОЖ	Опухолевая ткань
АДА (нмоль/мин*мг)	10,8±0,72	22,1±0,83*	14,4±1,48	26,5±1,68*
КО (мкмоль/мин*мг)	1,97±0,54	5,87±1,64*	2,23±0,81	7,40±1,32*
СОД (ед/мг)	46,4±6,60	7,43±1,77*	59,7±4,02	141±6,81*
ГПО (мкмоль/мин*мг)	23,6±0,96	16,1±0,45*	20,3±0,61	13,0±0,58*
NOx (мкмоль/л)	2,12±0,16	3,19±0,24*	2,40±0,14	4,45±0,66*

Примечание: * — значения показателя достоверны при p<0,001 относительно неизмененной ткани слизистой.

Полученные данные свидетельствуют об усиленной генерации АФК в опухолевой ткани, что согласуется с повышением активности АДА и КО, а так же уровнем NO_x и более выражено это проявляется на более поздних стадиях РЖ. При этом у больных 1-ой группы в ткани опухоли установлено снижение активностей ферментов первой линии защиты от окислителей — СОД и ГПО, что свидетельствует об ослаблении АОС и развитию окислительного стресса (ОС) у онкобольных. Однако во 2-ой группе нами были обнаружены неоднозначные изменения ферментативных активностей в системе антиоксидантной защиты: активность СОД повышалась в опухолевой ткани относительно СОЖ, в то время как ГПО снижалась.

Следует отметить, что именно фермент, который участвует в инактивации супероксиданион радикала (О^2-) резко изменяется в зависимости от стадии заболевания РЖ. Если у больных первой группы активность данного фермента снижается в опухолевой ткани желудка, в сравнении со смежными нетрансформированными тканями, то у больных второй группы, то есть у пациентов с более неблагоприятным прогнозом СОД увеличивается в ткани аденокарциномы желудка.

Данные изменения можно объяснить следующим: известно, что АФК наиболее интенсивно атакуют тиоловые белки, окисляя SH-группы, что приводит к их структурной модификации и соответственно изменением функциональной активности. Такими белками являются ключевые и ферменты метаболизма нуклеотидов и системы антирадикальной защиты, одним из которых является ГПО, снижая ее защитную функцию [13]. При этом усиление ОС, которое так же проявляется в повышении активности АДА, оказывающего существенное влияние на производство АКМ [14], способствует переходу КО из дегидрогеназной формы которая работает в физиологических условиях, в оксидазную – образующую супероксиданион радикал (О^2-) [15], еще больше нарабатывая АФК, тем самым замыкая порочный круг.

В свою очередь, в условиях гипоксии, характерной для РЖ, происходит стимуляция нитратредуктазной активности и как следствие возрастание уровня NOx необходимых для генерации  NO. Избыточный синтез NO сочетающийся с гиперпродукцией О^2- приводит к взаимодействию этих метаболитов друг с другом с образованием пероксинитрита (ONOO-), который способствует клеточной трансформации, действует как мощный прооксидант, взаимодействует или окисляет семейство киназ, факторы транскрипции [16], а так же способного к образованию нитрозаминов, обладающих канцерогенными свойствами, что в свою очередь препятствует гибели раковых клеток по механизму апоптоза, но способствуя усилению метастазирования опухолевых клеток [17]. Так как, опухолевый процесс, связан с усиленной генерацией АФК, оказывающих двоякую роль в канцерогенезе – выступая с одной стороны фактором прогрессии опухоли, а с другой – при очень высокой концентрации могут стимулировать апоптоз и некроз, тем самым повредить раковую клетку [18], следовательно, можно предположить, что повышение активности СОД у больных 2 группы, выступает как защитный механизм опухоли, способствуя ее выживанию и более быстрой прогрессии, что согласуется с клиническим течением заболевания у этой группы больных.

При этом, нарабатываемый СОД пероксид водорода H₂O₂ в ткани опухоли, скорее всего, проявляет свойства физиологического регулятора [19], нежели выступает как токсический и деструктивный агент, оказывая следующие эффекты в клетке: приводит к инактивации ферментов АОС, одним из которых выступает ГПО; снижает цитотоксический эффект фактора некроза опухоли, защищая опухолевые клетки от повреждения; усиливает окисление нитратов в нитриты, тем самым повышая пул NOx [20], что служит важным стимулятором индуцированной кровотоком вазодилатации,  тем самым способствуя усилению кровоснабжения опухолевых тканей [21], повышению транспорта питательных веществ и усилению метастазирования.

Заключение. Установлено увеличение активности АДА, КО и снижение ГПО как на ранних, так и на поздних стадиях рака желудка, при этом обнаружено, что изменение активности СОД имеет разнонаправленный характер – при ранних стадиях рака происходит снижение активности фермента, а при поздних повышение. Такие нарушения приводят к дисбалансу между ПОС и АОС, которые тесно связаны с ферментативными изменениями в обмене нуклеотидов, способствуя регуляции друг друга по принципу обратной связи, что в свою очередь оказывают существенное влияние на жизнеспособность опухолевой клетки и её функциональную состоятельность, что более характерно на поздних стадиях заболевания.

Список литературы:

1. Иванилов А. К. Заболеваемость злокачественными новообразованиями в мире, РФ и отдельных её регионах (обзор литературы). Молодой ученый, 2014. — №2. — С. 337-339.
2. Надеев А.П., Чернова Т.Г., Матина С.Т., Матин И.А., Козяев М.А.

   Структура онкологической заболеваемости по данным исследований гастробиопсий. Медицина и образование в Сибири, 2014. — № 3. —

3. Злокачественные новообразования в России в 2013 году (Заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена, филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России, 2015. — 250 с. ISBN 978-5-85502-205-6
4. С. С. Харнас, В. В. Левкин, Г. Х. Мусаев. Рак желудка: клиника, диагностика, лечение. М.: ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, 2006. — 84 с.
5. Лохов П. Г. Метаболом плазмы крови для диагностики и оценки риска возникновения рака простаты, рака легкого и сахарного диабета 2-го типа: диссертация доктора биологических наук: 03.01.04 / Лохов Петр Генриевич; [Место защиты: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»], 2015. — 307 с.
6. Бакурова Е.М. Дисметаболические процессы в эритроцитах у больных раком желудка и кишечника. Научные достижения биологии, химии и медицины в сфере экологии, здоровья и качества жизни человека. М.:, Издательство ИНГН, 2011. — С. 10-12.
7. С. А. Зуйков Исследование обмена нуклеотидов и его взаимосвязи с прооксидантной и антиоксидантной системами у людей различного возраста. Успехи геронтологии, 2014. — Т. 27. — № 3. — С. 463–467.
8. Карпищенко А. И. Медицинские лабораторные технологии: Руководство по клинической лабораторной диагностике в 2 т., 2013. — Т. 2. — С. 40-41
9. Макаревич О. П. Активность супероксиддисмутазы крови в острый период различных заболеваний. Лаб. дело, 1983. — № 6. — С. 24-27.
10. Moin V. M. Simple and specific method of measurement of glutathione peroxidase activity in the erythrocytes. Lab Manuals, 1986. —№ 12. — P. 724-727.
11. Мажитова М. В. Спектрофотометрическое определение уровня метаболитов монооксида азота в плазме крови и ткани мозга белых крыс. Современные проблемы науки и образования, 2011. — № 3; URL: www.science-education.ru/97-4655
12. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951. — Vol. 193. — № 21. — P. 265 -275.
13. Yun J. W., Lum K., Lei X. G. A novel upregulation of glutathione peroxidase 1 by knockout of liver regenerating protein Reg3beta aggravates acetaminophen-induced hepatic protein nitration. Free Radic.Biol.Med., 2013. — Vol. 65. — P. 291-300.
14. Erkilic, K., et al. «Adenosine deaminase enzyme activity is increased and negatively correlates with catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase in patients with Behcet’s disease: original contributions/clinical and laboratory investigations.» Mediators.Inflamm., 2003. —Vol. 12. — № 2. — P. 107-116.
15. McNally JS, Saxena A, Cai H, Dikalov S, Harrison DG. Regulation of xanthine oxidoreductase protein expression by hydrogen peroxide and calcium. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2005. — Vol. 25. — P. 1623–1628.
16. Kundu J.K., et al. Emerging avenues linking inflammation and cancer. Free Radic. Biol. Med., 2012. — Vol. 52. . — P. 2013–2037.
17. Kamat J. P. Peroxynitrite: a potent oxidizing and nitrating agent. Indian J. Exp. Biol., 2006. — Vol. 44. — № 6. — P. 436-447.
18. Kariya S., Sawada K., Kobayashi T., et al. Combination treatment of hydrogen peroxide and X-rays induces apoptosis in human prostate cancer PC-3 cells. Int. J Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2009. — Vol. 75. — № 2. — Р. 449-454.
19. Kiruthiga P.V., et al. «Protective effect of silymarin on erythrocyte haemolysate against benzo(a)pyrene and exogenous reactive oxygen species (H2O2) induced oxidative stress. Chemosphere., 2007. — Vol. 68. — № 8. — P. 1511-1518.

20. Меньщикова Е. Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. Е. Б. Меньщикова, В. З. Ланкин, Н. К. Зенков, И. А. Бондарь, Н. Ф. Круговых, В. А. Труфакин. М.: Фирма «Слово», 2006. — 556 с.

21. Zhang DX, Borbouse L, Gebremedhin D, Mendoza SA, Zinkevich NS, Li R, Gutterman DD. H2O2-induced dilation in human coronary arterioles: role of protein kinase G dimerization and large-conductance Ca2+-activated K+ channel activation. Circ Res., 2012. — Vol. 110. — № 3. — P. 471-480.[schema type=»book» name=»ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ, ПРООКСИДАНТНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА» description=»Изучено состояние прооксидантной и антиоксидантной систем у больных раком желудка в зависимости от стадии заболевания в опухолевых тканях в сравнении с нетрансформированной слизистой желудка, а также проанализирована взаимосвязь обменов антиоксидантной/прооксидантной систем и обмена нуклеотидов. Материалом были опухолевые и смежные ткани желудка 26 больных в возрасте 60-79 лет. Изучили активность ферментов обмена пуриновых нуклеотидов – аденозиндезаминазу (АДА) и ксантиноксидазу (КО), которая также обладает прооксидантными свойствами; антиоксидантную защиту – глутатионпероксидазу (ГПО) и супероксиддисмутазу (СОД); уровень нитратов/нитритов (NOх). Методом изучения активности ферментов и уровня NOх была спектрофотометрия. Нами установлено увеличение активности АДА, КО и снижение ГПО как при 1-2 стадии, так и на 3-4 стадиях рака желудка. В обоих случаях отмечено увеличение уровня NOx в опухолевой ткани относительно нетрансформированной слизистой желудка. Изменение СОД имеет разнонаправленный характер – при ранних стадиях рака происходит снижение активности фермента (в 6,2 раза), а при поздних повышение (в 2,4 раза).» author=»Зуйков Сергей Александрович, Шатова Ольга Петровна, Хомутов Евгений Владимирович, Каплун Дарья Сергеевна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-02-08″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_29.08.15_08(17)» ebook=»yes» ]