Актуальной задачей медицинской биотехнологии является разработка лекарственных препаратов и медицинских изделий для лечения повреждений кожи. Разработки в этой области затрагивают широкий спектр проблем, связанных с заживлением ран, профилактикой и лечением послеоперационных, травматических и послеожоговых рубцов, шрамов и спаек. В связи с тем, что основу рубцов составляет фибриллярный белок – коллаген, для их коррекции широко применяют фермент, лизирующий этот белок, коллагеназу. Уникальность этого фермента заключается в его способности расщеплять в коллагене специфические пептидные связи, которые практически не поддаются гидролизу другими ферментами. Коллагеназы применяются в составе многих лекарственных препаратов косметического, медицинского и ветеринарного назначения, а также в пищевой и кожевенно-меховой промышленностях.
Одна из главных проблем пищевой промышленности состоит в создании безотходных технологий за счет максимального привлечения вторичных белковых ресурсов и отходов мясной промышленности. Обеспечение устойчивого подъёма в этом направлении может быть достигнуто за счет разработки высокоэффективных ферментных препаратов.
Практика применения ферментных препаратов показывает, что не все ферменты, обладающие высокой протеолитической активностью, при обработке отходов мясной промышленности дают необходимый эффект. Это связано с наличием в них белков, наиболее трудно расщепляемых пищеварительными ферментами, основным из которых является коллаген. Один из способов решения данной проблемы заключается в использовании коллагенолитических ферментов.
Известные на сегодняшний день коллагенолитические ферменты имеют ряд существенных недостатков. Наиболее известный продуцент коллагеназы – бактерия Clostridium hystoliticum, является возбудителем газовой гангрены, смертельно опасного заболевания, вследствие чего предъявляются повышенные требования безопасности на всех стадиях производства и реализации данного ферментного препарата [1]. Другой известный фермент, обладающий коллагенолитической активностью – крабовая коллагеназа, выделяемая из гепатопанкреаса (орган, совмещающий функции печени и поджелудочной железы) камчатского краба. Она безопасна для человека, но имеет ограничения для масштабного производства и значительную вариабельность по степени чистоты и активности фермента [2].
Вследствие этого наиболее значимой представляется проблема поиска продуцентов коллагеназ, у которых отсутствовали бы перечисленные выше недостатки.
Перспективным объектом биотехнологии являются высшие грибы – базидиомицеты. Большой интерес представляет проведение комплекса работ, направленных на обнаружение новых ферментов, синтезируемых высшими грибами. Интерес к грибным ферментам обусловлен возможностью культивирования продуцента в контролируемых условиях, что приводит к относительной стандартизации получаемых ферментных препаратов и возможности производства ферментов в промышленных масштабах.
На кафедре технологии микробиологического синтеза Санкт–Петербургского государственного технологического института (технического университета) проводился скрининг ряда культур базидиомицетов, отличающихся высоким уровнем коллагенолитической активности. Объектами исследования служили штаммы культур базидиомицетов из коллекции кафедры. Плодовые тела данных грибов были собраны на Северо-Западе России, охарактеризованы и выделены в чистые культуры. Скрининг продуцентов коллагенолитического фермента проводился среди 35-и видов базидиомицетов, относящихся к 9-ти родам: Bjerkandera, Coriolus, Coprinus, Flammulina, Trametes, Cerrena, Panus, Ganoderma и Funalia. Результаты скрининга показали, что наиболее высокой коллагеназной активностью обладает культура высшего гриба Coprinus sp.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Объектом исследования являлся штамм базидиального гриба Coprinus sp. из коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза СПбГТИ(ТУ). Поддержание музейной культуры проводили путем периодического пересева (каждые два месяца) на скошенную твердую питательную среду – агаризованную среду Сабуро.
Состав среды Сабуро, г/л: глюкоза – 40, пептон – 10, агар – 20-25.
Выращивание глубинной культуры базидиомицета. Глубинное культивирование гриба проводили на средах с различными источниками азота (пептон, мочевина, цитрат и нитрат аммония) и соотношениями источника углерода (глюкоза) и азота в составе питательных сред (таблица 1). Минеральный состав питательных сред, г/л: NaCl – 0,5, KH2PO4 – 0,6, K2HPO4 – 0,4, MgSO4 – 0,5, CaCl2 – 0,05, FeSO4×7H2O – 0,005, ZnSO4×7H2O – 0,001. В качестве фактора роста во все среды вносили дрожжевой экстракт из расчета 2 г на 1 л среды. Продолжительность культивирования – 7 суток.
На 3, 4, 5, 6 и 7-е сутки отбирали пробы культуральной жидкости, определяли pH и количество накопленной биомассы. Полученный нативный раствор использовали для дальнейшего изучения содержания белка и определения коллагенолитической активности.
Таблица 1.
Соотношение источников C и N в составе питательных сред
|
Компоненты питательной среды |
Соотношение источников C и N |
||||
| 1,2:1 | 1,5:1 | 3:1 | 5:1 | 10:1 | |
| Источник углерода, г/л | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Источник азота, г/л | 8,33 | 6,67 | 3,33 | 2 | 1 |
Определение количества накопленной биомассы. Культуральную жидкость, отобранную на определенные сутки культивирования, разделяли на нативный раствор и влажную биомассу фильтрованием через бумажный фильтр. Влажную биомассу высушивали при температуре 50℃. Нативный раствор в дальнейшем использовался для определения pH, концентрации белка и коллагенолитической активности глубинной культуры гриба.
Определение pH нативного раствора культуральной жидкости. pH нативного раствора культуральной жидкости базидиомицета Coprinus sp. определяли с помощью pH-метра марки pH-150М в комплекте с лабораторным стеклянным комбинированным электродом ЭСКЛ-08М.
Определение концентрации белка. Для определения количества образовавшегося в процессе глубинного культивирования белка, необходимого для последующего расчета удельной активности ферментов, использовали метод Лоури [3].
Определение коллагенолитической активности. Коллагеназную активность определяли нингидриновым методом [4]. Метод измерения активности основан на способности фермента расщеплять коллаген с освобождением и переводом в раствор продуктов гидролиза, концентрацию которых определяют спектрофотометрически. За единицу коллагенолитической активности (КЕА) принимали такое количество мкг фермента (коллагеназы), при воздействии которого на коллаген за 1 час выделяются продукты гидролиза, эквивалентные 1 мкг L-лейцина, в стандартных условиях опыта.
Активность в коллагенолитических единицах (КЕА) на 1 мл нативного раствора культуральной жидкости Ак вычисляли по формуле (1):
Ак = а×V×2,5 (1)
где: а – разность концентрации испытуемого Ci и контрольного Co раствора, мкг/мл; V – объем испытуемого раствора, мл.
Удельная коллагеназная активность рассчитывалась как отношение общей коллагенолитической активности к концентрации белка в наивном растворе культуральной жидкости продуцента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Согласно полученным данным, наибольшее количество биомассы культура базидиального гриба Coprinus sp. продуцирует на 5-е сутки культивирования при использовании в качестве источника азота мочевины (14,9 г/л), а наименьшее – при культивировании на аммонийных источниках азота (1,0-1,9 г/л). Глюкозо-пептонная среда занимает промежуточное положение по количеству накапливаемой грибом биомассы.
В процессе культивирования продуцента на среде с мочевиной происходит сильное защелачивание среды (pH 9,1), в то время как использование нитрата аммония в качестве источника азота ведет к сильному закислению среды (pH 3,2). pH глубинной культуры, полученной на среде состава глюкоза:цитрат аммония, слабокислый (pH 4,2-6,0). Выращивание гриба на глюкозо-пептонной питательной среде сопровождается переходом pH от слабокислого (pH 5,4) к слабощелочному (pH 8,4).
Наибольшая концентрация белка в культуральной жидкости гриба достигается на 4-5-е сутки культивирования на глюкозо-пептонной питательной среде с соотношением источников углерода и азота, равном 1,2:1 (3,9 г/л), а наименьшая – при культивировании на аммонийных источниках азота (0,6-0,7 г/л). Среда с мочевиной занимает промежуточное положение по количеству накапливаемого белка.
Полученные результаты (рисунки 1-4) позволяют утверждать, что наибольшую удельную коллагенолитическую активность глубинная культура базидиомицета Coprinus sp. проявляет на 6-е сутки культивирования на среде, где источником азота является пептон, при соотношении источника углерода и азота, равном 5:1. Высокая удельная коллагеназная активность продуцента также наблюдается на 7-е сутки культивирования на среде с мочевиной при соотношении источника углерода и азота, равном 10:1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Базидиомицет Coprinus sp., отобранный по результатам скрининга, проведенного на кафедры технологии микробиологического синтеза СПбГТИ(ТУ), обладает высокой коллагенолитической активностью и является перспективным продуцентом высокоактивного препарата грибной коллагеназы.
Согласно полученным данным, наибольшую удельную коллагенолитическую активность глубинная культура базидиального гриба Coprinus sp. проявляла на 6-е сутки на среде, где источником азота является пептон, при соотношении источника углерода и азота, равном 5:1. Высокая удельная коллагеназная активность продуцента также наблюдалась на 7-е сутки культивирования на среде с мочевиной при соотношении источника углерода и азота, равном 10:1.
В связи с этим, результаты исследования могут предоставить возможность замены традиционно используемого дорогостоящего источника азота в составе питательной среды (пептона) на более дешевый (мочевина), что значительно уменьшит стоимость получаемого продукта – грибной коллагеназы.
Таким образом, колагенолитический фермент, выделяемый из базидиального гриба Coprinus sp., обладает не только технологическими, но и экономическими преимуществами по сравнению с существующими на сегодняшний день препаратами коллагеназ.
Список литературы:
- Демина Н. С. Коллагенолитические ферменты синтезируемые микроорганизмами // Микробиология. Т. 65, №3. С. 293-304.
- Руденская Г. Н. Брахиурины – сериновые коллагенолитические ферменты крабов // Биоорганическая химия. 2003. Т. 29, №2. С. 117-126.
- Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // Biol. Chem. V. 193, №1. P. 265-275.
- Rosen H. Modified ninhydrin colorimetric analysis for amino acids // Biochemistry. Biophys. 1957. 67. P.10-15.[schema type=»book» name=»ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛАГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ВЫСШИХ ГРИБОВ» author=»Федорюк Елизавета Дмитриевна, Шамцян Марк Маркович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-05-31″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)» ebook=»yes» ]