БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ОКРАШЕННОГО РАСТВОРА

1. Введение.

Люминесцентный метод ингибирования свечения фотобактерий является важным инструментом для оценки токсичности различных химических веществ, где измеряется снижение светового потока в связи с взаимодействием бактерий и токсичных соединений [3]. Способ является относительно быстрым, потому что время инкубации составляет от 5 до 30 мин. Результаты можно сравнить с другими исследованиями по токсичности. Тест стандартизирован для воды и образцов сточных вод, но оценка токсичности окрашенных или мутных образцов с помощью этого метода затруднена и это невозможно из-за помех в измерениях. У мутныхрастворов и плохо растворимых соединений, прямой контакт с бактериями затруднен и это затрудняет точную оценку индекса токсичности [4].

Раствор анилина (фениламин С₆Н₅MH₂)производят в промышленном масштабе и используют для приготовления n-нитроанилина, одного из важных полупродуктов в производстве красителей. На основании этих характеристик данное вещество было нами исследовано.

Цель работы- оценка токсичности раствора анилина с помощью стандартного бактериального люминесцентного метода и его модификации.

2. Материалы и методы

Объект исследования.В качестве тест организма использовали бактерий генно-инженерного штамма Escherichiacoli K12 TG1 со светящимся фенотипом, созданным при клонировании гибридной плазмиды, включающей полный lux-оперон из светящихся почвенных бактерий Photorhabdusluminescens ZM1 — биосенсора тест-системы «Эколюм-08» [1].

Стандартный 30 минутный опыт. Сохраняя достоинства метода с использованием морских светящихся бактерий, мы применили в качестве тесторного объекта рекомбинантный штаммE. coli, которыйв отличие от морских люминесцентных бактерий, не требует присутствия в среде NaCl, искажающий показатели токсичности.

В исследовании использовали препарат «Эколюм-08». Регидратациюлиофилизированных клеток проводили в дистиллированной воде в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее готовили суспензиюбактерий разбавлением раствора клеток до концентрации 2х10⁷кл/мл. Измерение интенсивности свечения проводилось на 30 с, 5, 15 и на 30 минуте инкубации бактерий с раствором анилина.

Интенсивность биолюминесценции бактерийизмеряли на люминометреLuminometer 1251 BioOrbit (Финляндия) (Россия) в течение 30 минут. Для измерения интенсивности свечения клеток формировали пробу, которая содержала 0.1 мл суспензии бактерий и 0.9 мл дистиллированной воды (контроль) и такой же объём раствора анилина с различными концентрациями [2].Измеряли световой поток в течение 30 с и потом в 5, 15 и 30 мин после добавления токсиканта к бактериям в кювету. Все образцы были проанализированы в трех поверхностях.Интенсивность свечения измеряли в имп/сек. Индекс токсичности определяли по формуле:

Т=100(I₀–I_t)/I₀

-где I₀ и I_t  соответсвенно интенсивность биолюминесценции в определенный момент времени «t» в контроле и в присутствии токсиканта. Кроме того вычисляли общепринятые для данного метода токсикологические параметры ЕС — эффективная концентрация: ЕС₁₀ — нижний предел достоверного измерения токсичности, ЕС₂₀ — концентрации, вызывающие токсичность, ЕС₅₀ — концентрации, вызывающие острую токсичность, ЕС₉₀  — верхний предел достоверного определения токсичности.

Значения индекса токсичности были определены с использованием опорных времен инкубации 30 с или 30 мин.

Погрешность в измерении интенсивности биолюминесценции во всех экспериментах не превышала 10%.

3. Результаты и их обсуждение.

У многих химических веществ, токсические эффекты получаются после очень короткого времени контакта с люминесцентными бактериями. Тем не менее, различные химические вещества имеют различные режимы для определения токсичности. Таким образом, кинетические данные по токсичности образцов имеют разные 5, 15 или 30 минут временные возможности для получения достоверных результатов.В течение 30 минут инкубации анилина с E.coli была обнаружена очевидная зависимость индекса токсичности от различных концентраций анилина во времени. Данные представлены на Рисунке 1 и 2 – это стандартный метод оценки показателей по токсичности.

Сразу же после добавления раствора анилина к люминесцентным бактериям наблюдается снижение интенсивности свеченияклеток и высокая токсичность, которая во времени незначительно снижается. Достоверное тушение свечения происходит, если концентрация исследуемого соединения была не менее 0,15 мг/л.

Основные параметры ингибирования биолюминесценции ЕС₁₀, ЕС₂₀ и ЕС₅₀ в 30 минутном опыте были равны следующим величинам 0,09 мг/л, 0,15 мг/л и 0,34 мг/л соответственно. Достигнуть параметра ЕС₉₀ даже при концентрации анилина в 0,5 мг/л не удалось, поскольку через 30 минут ингибирование свечения составляло лишь 73% от контроля.

В нашем исследовании мы попытались сопоставить индексы токсичности при разных концентрациях анилина, которые получены стандартным биолюминесцентным методом с данными, экспресс анализа, гдепри расчете, опытный образец в нулевое время. выступал в качестве контроля, и, следовательно, это позволило произвести коррекцию цвета с минимальным отклонением. При таком расчете индекс токсичности анилина при концентрации 0,17 мг/л имел значение 2,5, а при концентрации 0,34 мг/л был 24 соответственно, что в два раза меньше по токсичности, по сравнению со стандартным методом расчета индекса токсичности, где в качестве контроля выступали клетки биосенсора в воде.

Кинетика токсического действия раствора анилина, как и некоторых химических веществ быстра. При внесении реагента эффект проявляется мгновенно, свечение бактерий значительно снижаетсяуже в первые секунды. И этот эффект,хорошо виден с органическими токсикантами, имеющими небольшой молекулярный вес.

Следовательно, сопоставление двух подходов в расчете индекса токсичностианилина позволилоучитывать такие факторы, как быстрая кинетика и цвет исследуемого вещества, что сильно может влиять на достоверные результаты по токсичности.

 

Список литературы:

1. ДаниловВ. С., ЗарубинаА. П., ЕрошниковГ. Е., СоловьеваЛ. Н., КарташевФ.В, ЗавильгельскийГ.Б. (2002) Сенсорныебиолюминесцентныесистемынаосновеlux-опероновразныхвидовлюминесцентныхбактерий. Вестн. Моск. университета, сер. биология, 3, с. 20-24.
2. Ревазова Ю. А. (2007)Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, матералов и изделий с помощью биотеста «Эколюм» / Ю. М.: Методическиерекомендации. -17 с.
3. Dutka BJ, Kwan KK., Rao SS, Jurkovic A, McInnis R. Use of bioassays to evaluateriver water and sediment quality. EnvironmToxicol and Water Qual Intern J 1;(6):309-32
4. Lappalainen, J., Juvonen, R., Vaajasaari, K., Karp, M. A new flash method for measuring the toxicity of solid and colored samples. //Chemosphere. 1999. V.38. N5. р.1069-1083.[schema type=»book» name=»БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ОКРАШЕННОГО РАСТВОРА» description=»В работе использовался биолюминесцентный метод для оценки токсичности раствора анилина.Экспресс-анализ осуществлялся с помощью автоматического люминометра с программным обеспечением. Исследование проводилось во времени, и каждый образец являлся контролем в нулевое время, и, следовательно, таким образом происходила коррекция цвета во времени. К люминесцентным бактериям добавляли окрашенное вещество, и свечение записываливо времени от 30 с. до 30 мин. Максимальный сигнал, полученный в начале опыта сравнивали с сигналом после инкубационного периода. Индекс токсичности в этом тесте сопоставляли со стандартным протоколом испытаний фотобактерий. » author=»Сорокина Елена Владимировна, Зарубина Алевтина Петровна» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-03-30″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.04.2015_04(13)» ebook=»yes» ]