30 Дек

ВЫБОР ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ГИДРОЛИЗА СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

Для получения гидролизатов сывороточных белков ферментными препаратами необходимо подобрать наиболее эффективные параметры данного технологического процесса, которые бы обеспечивали ферментативный гидролиз полипептидной цепи с образованием низкомолекулярных пептидов. При этом для гидролиза сывороточных белков целесообразно использование ферментных препаратов, характеризующихся эндопептидазной активностью. Это дает возможность проводить процесс гидролиза в более щадящих условиях по сравнению с использованием химических агентов [5, с. 47].

Кислотный гидролиз характеризуется рядом недостатков: во-первых, при кислотном гидролизе наблюдается полное разложение триптофана и многих других аминокислот, во-вторых образующийся при этом гидролизат приобретает темную окраску, в-третьих возникает проблема удаления кислоты и ее солей из получаемого гидролизата. Щелочной гидролиз способствует потере биологической ценности гидролизата в результате рацемизации аминокислот. Ферментативный гидролиз практически полностью исключает повреждение аминокислот и утрату биологической ценности образуемого продукта [2, с. 47].

Известно, что все ферментные препараты характеризуются удельной активностью, а также оптимальным диапазоном pH и температуры, при котором они проявляют наибольшую активность [3, с. 391]. Для проведения исследований были выбраны три ферментных препарата, обладающих эндопептидазной активностью. Результаты анализа данных ферментов представлены в табл. 1.

Таблица 1 — Характеристика используемых ферментных препаратов

Название фермента

Вид фермента Оптимальный рН Молекулярная масса, Да

Удельная активность,

Термолизин Эндопептидаза 6,5-8,5 34 600 40
Пепсин 5,0-6,5 35 000 26
Бромелайн 4,5-9,0 28 000 65

Из вышеуказанных данных можно сделать вывод о том, что наибольшей удельной активностью в 65 усл. ед / мг обладает бромелайн, а наименьшей (26 усл. ед / мг) – пепсин. Бромелайн характеризуется также наибольшим диапазоном действия pH из всех выбранных ферментов – от 4,5 до 9,0. Термолизин и пепсин обладают схожими значениями молекулярных масс, в то время как молекулярная масса бромелайна на 20% ниже, что стоит учитывать при проведении гидролиза. Стоит отметить, что в общем случае по сравнению с экзопептидазами эндопептидазы характеризуются более широким спектром pH, при котором они проявляют наибольшую протеолитическую активность [4, с. 515].

Вначале исследовали влияние ферментных препаратов на процесс гидролиза пептидных связей молекул сывороточных белков. Ферментативный гидролиз проводили при уровне pH 6,5, оптимальной температуре для данных ферментов 35°С в течение 8±0,05 ч, при фермент-субстратном соотношении 1:100. Результаты исследований степени гидролиза отражены в табл. 2.

Таблица 2 – Степень гидролиза сывороточных белков

Степень гидролиза, %

Термолизин Пепсин Бромелайн
33,45±1,6 31,68±1,5 34,59±1,7

Данные исследований свидетельствуют о том, что степень ферментативного гидролиза не превышает 35 %, что вполне согласуется с литературными данными. Наибольшая степень гидролиза (34,59 %) наблюдается у бромелайна, что на 3,4 % выше, чем у термолизина и на 9,2 % больше, чем у пепсина.

Анализ фракционного состава сывороточных белков различными ферментами представлен в табл. 3.

Таблица 3 – Фракционный состав сывороточных белков до и после ферментативного гидролиза

Массовая доля азота во фракциях, %

Состояние белка

До гидролиза После гидролиза термолизином После гидролиза пепсином

После гидролиза бромелайном

общее содержание 14,04±0,7 4,96±0,25 4,34±0,21 5,23±0,26
β-лактоглобулин 5,84±0,29 2,44±0,12 2,22±0,11 2,46±0,12
α-лактальбумин 2,67±0,13 1,05±0,05 0,82±0,04 1,34±0,07
сывороточный альбумин 0,90±0,05 0,30±0,02 0,29±0,01 0,34±0,02
иммуноглобулины 2,10±0,11 0,63±0,03 0,55±0,03 0,58±0,03
протеозо-пептоны 2,53±0,13 0,54±0,03 0,46±0,02 0,51±0,03

В процессе ферментативного гидролиза сывороточных белков термолизином массовая доля β-лактоглобулина и α-лактальбумина сократилась соответственно в 2,2 и 2,5 раза, а массовая доля сывороточного альбумина и иммуноглобулинов — в 3 и 3,3 раза соответственно. Наибольшему изменению подверглись протеозо-пептоны – в процессе гидролиза термолизином они сократились в 4,7 раза.

При гидролизе пепсином наблюдаются схожие значения изменений фракций белков: остаточное количество β-лактоглобулина и α-лактальбумина составило 38 % и 30 %, для сывороточного альбумина, иммуноглобулинов и протеозо-пептонов эти значения равны соответственно 32 %, 26 % и 18 %. В случае гидролиза сывороточных белков бромелайном остаточное количество вышеуказанных фракций составило 42 %, 50 %, 38 %, 28% и 20 %.

Для более глубокого анализа процессов, протекающих при ферментативном гидролизе, были проведены исследования молекулярно-массового распределения белковых фракций, образующихся под действием протеолитических ферментов. Гидролиз проводили при активной кислотности pH 6,5, температуре 35°С в течение 8±0,05 ч, при фермент-субстратном соотношении 1:100. В качестве контрольного образца выбрали сывороточный белок, не подвергшийся ферментативному гидролизу, с молекулярной массой 35 кДа. Молекулярно-массовое распределение получали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле методом Леммли. Результаты отражены в табл. 4.

Таблица 4 — Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов в результате ферментативного гидролиза

Молекулярная масса, кДа

Массовая доля фракций, %
Термолизин Пепсин

Бромелайн

Более 30 1,77±0,08 2,46±0,12 1,21±0,06
20-30 3,26±0,16 3,99±0,19 3,45±0,17
20–10 19,97±0,99 18,38±0,92 21,69±1,08
10–5 31,12±1,55 35,05±1,75 29,15±1,45
Менее 5 43,88±2,19 40,12±2,01 44,50±2,22

Анализ представленных результатов позволяет сделать вывод о том, что в ходе ферментативного гидролиза сывороточных белков происходит перераспределение фракций, при этом соотношение отдельных фракций зависит от вида используемого ферментного препарата. При гидролизе в течение 10 ч массовая доля фракций с молекулярным весом более 30 кДа заметно сокращается и составляет 1,77 % при использовании термолизина, 2,46 % — при использовании пепсина и 1,21 % при использовании бромелайна. Большая часть фракций приходится на белки с низкой молекулярной массой – менее 10 кДа.

Для анализа биологической ценности полученных гидролизатов был проведен анализ аминокислотного состава до и после проведения ферментативного гидролиза [1, с. 167]. Результаты данного анализа отражены в табл. 5

Таблица 5 – Динамика накопления свободных аминокислот в результате гидролиза сывороточных белков, %

Аминокислоты

Исходный образец белка (связанные) Термолизин (свободные) Пепсин (свободные)

Бромелайн (свободные)

Незаменимые аминокислоты

Валин 6,63±0,33 2,22±0,11 2,10±0,11 2,29±0,11
Изолейцин 5,21±0,26 1,74±0,09 1,65±0,08 1,80±0,09
Лейцин 9,14±0,46 3,06±0,15 2,90±0,14 3,16±0,16
Лизин 6,5±0,33 2,17±0,11 2,06±0,10 2,25±0,11
Метионин 2,59±0,13 0,87±0,04 0,82±0,04 0,90±0,04
Треонин 4,05±0,20 1,35±0,07 1,28±0,06 1,40±0,07
Триптофан 1,32±0,07 0,44±0,02 0,42±0,02 0,46±0,02
Фенилаланин 4,58±0,23 1,53±0,08 1,45±0,07 1,58±0,08

Заменимые аминокислоты

Аланин 2,78±0,14 0,93±0,05 0,88±0,04 0,96±0,05
Аргинин 4,09±0,20 1,37±0,07 1,30±0,06 1,41±0,07
Аспарагиновая кислота 6,47±0,32 2,16±0,11 2,05±0,10 2,24±0,11
Гистидин 2,22±0,11 0,74±0,04 0,70±0,04 0,77±0,04
Глицин 2,69±0,13 0,90±0,04 0,85±0,04 0,93±0,05
Глутаминовая кислота 19,18±0,96 6,42±0,32 6,08±0,30 6,63±0,33
Пролин 9,45±0,47 3,16±0,16 2,99±0,15 3,27±0,16
Серин 6,81±0,34 2,28±0,11 2,16±0,11 2,36±0,12
Тирозин 5,86±0,29 1,96±0,10 1,86±0,09 2,03±0,10
Цистеин 0,43±0,02 0,14±0,01 0,14±0,01 0,15±0,01
Всего 100±5,0 33,45±1,67 31,68±1,58 34,59±1,73

По данным, представленным в табл. 5 следует, что наибольшее накопление для всех аминокислот наблюдается при ферментативном гидролизе бромелайном, который характеризовался наибольшей протеолитической активностью в 65 усл. ед / мг. Максимальное накопление при обработке данным ферментом наблюдается у таких аминокислот как аргинин и тирозин.


Таким образом, обобщая результаты экспериментов можно сделать вывод о том, что из всех исследованных ферментов наибольшая эффективность гидролиза сывороточных белков наблюдается при использовании бромелайна. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовался именно этот ферментный препарат.

Список литературы:

  1. Влияние фракционного состава и степени гидролиза на биологическую ценность и усвояемость молочных белков / А.М. Сафронова, А.С. Витолло, В.И. Круглик и др. // Актуальные проблемы переработки молока и производства молочных продуктов: тезисы докладов Всесоюзного научно-технического симпозиума. – Вологда, 1989. – С. 167–168.
  2. Гмошинский, И.В. Получение и перспективы использования ферментативных гидролизатов сывороточного белка молока / И.В. Гмошинский, С.Н. Зорин, В.И. Круглик и др. // Питание здорового и больного человека: материалы конференции. – СПб., 2006. – С. 47–49.
  3. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат, 1987. – 391 с.
  4. Диксон, М. Ферменты. В 3 т. / М. Диксон, Э. Уэбб; пер. с англ. – М.: Мир, 1982. – Т. 2. – 515 с.
  5. Зорин, С.Н. Получение ферментативного гидролизата белков молочной сыворотки, модифицированного по аминокислотному составу / С.Н. Зорин, В.И. Круглик // Питание здорового и больного человека: материалы конференции. – СПб., 2006. – С. 47–49.
    ВЫБОР ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ГИДРОЛИЗА СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ
    Written by: Бондарчук Ольга Николаевна
    Published by: БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА
    Date Published: 06/14/2017
    Edition: ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)
    Available in: Ebook