30 Дек

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФУЛЛЕРЕНОЛА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНЬЮ




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

Введение

В настоящее время синтез  и исследование водорастворимых фуллереновых структур, обладающих высокой биосовместимостью и широким спектром биологической активности,  является  быстроразвивающимся  мировым направлением. Среди  водорастворимых соединений фуллеренов  широко изучаются и используются   при создании медицинских и косметических препаратов полигидроксилированные фуллерены или  фуллеренолы С60(ОН)х, где х может изменяться  от 16-18   до 40-44,  [1.335с.]. Фуллеренолы являются мощными антиоксидантами прямого действия (ловушками свободных радикалов) как in vitro, так и in vivo, обладают защитным действием от ионизирующей радиации, антимутагенным, противоопухолевым и антиметастатическим эффектами.

Фуллеренолы находят все возрастающее использование  в медицине  фармацевтике и  в  парфюмерно-косметической  отрасли, но в то же время до сих пор  данные о их свойствах   и  токсичности     неоднозначны   Это может быть связано со сложностью синтеза и анализа структур фуллеренолов, что обусловлено  теоретической возможностью существования множества их изомеров и аналогов. Как правило, продукты процессов гидроксилирования  фуллерена С60, независимо от используемого способа, представляют  собой  смеси нескольких изомеров или аналогов с большим или меньшим числом гидроксильных групп общей формулы С60 (ОН)m (O)n, где значения m и n  изменяются  в каждом молекулярном составе [4 с.460-469]  В то же время состав и химическая структура смесей  гидроксилированных фуллеренов зависят от метода синтеза и исходных материалов [5-6]. В наиболее распространенных  методиках синтеза фуллеренолов, использующих   гомогенно-каталитическое щелочное  окислением С60, где в качестве поставщика ОН групп используют NaOH    наряду с  гидроксифуллереном  С60 (ОН)х образуются  оксигидроксифуллерены и их натриевые соли C60(OH)х(O)у(ONa)z [7]

Так как коммерческие фуллеренолы вряд ли  являются чистой формой  гидроксифуллеренов,    вызывает опасение потенциальное  негативное воздействие продуктов, включающих в свой состав  фуллеренолы, на человека. Поэтому проблемами, возникающими в связи    с  увеличивающими масштабами использования  фуллеренолов, являются, как  выделение чистых форм фуллеренолов, так и  мониторинг  новых  продуктов полученных на их основе.

В  [8 c.1093-1097] сообщалось, что при использовании в синтезе фуллеренолов в качестве исходного материала    допированной железом фуллереновой сажи получены  растворимые в воде железосодержащие фуллеренолы. Цель настоящего исследования- изучить особенности взаимодействия водорастворимых железосодержащих фуллеренолов  с быстро растущей тканью патологического и нормального эмбрионального происхождения для выявления защитных механизмов на уровне функциональной системы мать-плод, выявить степень эмбриотоксичности, антиметастатической активности и степень антиоксидантных свойств,

Экспериментальная часть

Вопросы эмбриотоксичности фуллеренола  состава С60 (ОН)х (О)у  (х+y=24-26), содержащего в своем составе  ~ 0,05-0,08 %  железа, изучались на модели куриного эмбриона с целью исключения опосредованного влияния материнского организма. Исследование  противоопухолевой и антиметастатической активности Fe-содержащих фуллеренолов          С60(ОН)х(О)у/Fe и С60,70(ОН)x(О)у/Fe (x+y =36-38) с содержанием железа 2,02% и 1,8%, соответственно.  проводилось на мышах, пораженных  карциномой Эрлиха.

Железосодержащие фуллеренолы были получены  с использованием в качестве исходного материала фуллереновой сажи, допированной железом (FeФС) непосредственно в процессе плазмо-химического синтеза фуллеренов.  Железо вводили в фуллеренообразующую плазму

Фуллеренол С60(ОН)х(О)у (х+y=24-26) с 0,05-0,08 % железа   получали гидроксилированием железосодержащего фуллерена С60, выделенного традиционными методами (экстракцией и хроматографированием органическими растворами из FeФС.  Fe-содержащие фуллеренолы С60(ОН)x(О)у/Fe и С60С70(ОН)x(О)у/Fe (x+у ~ 38-40) с 2,0% и 1,2% железа, соответственно,  получали  исходя непосредственно из FeФС  методом, описанным в [8. С.1093-1097]. Осуществляли  низкотемпературный  отжиг «нефуллереновой сажи» в  FeФС,  инициируемый добавкой ацетилацетоната железа, удаляли железо, растворившееся при кипячении в растворах HCl и далее осуществляли гидроксилирование  железо-фуллеренов в нерастворившемся остатке.

Гидроксилирование Фуллеренов проводили концентрированной HNO3, с последующим гидролизом полинитрофуллеренов в Н2О-растворах [10, с.90-93].

Для  выделения фуллеренолов C60 из смесей использовали   метод  колоночной хроматографии  водно-ацетоновыми растворами.     Продукты были охарактеризованы  по данны ИК-спектроскопии, Энергодисперсионного рентгеновского микроанализа, ЭПР- спектроскопии, ФЭС

Для изучения влияний фуллеренола С60 (ОН)х (О)y на  развитие эмбриона  было использовано семьдесят оплодотворенных куриных яиц, средний вес которых  при закладке в термостат для искусственной инкубации составил 50 – 54 гр., достоверных отличий в весе между контрольной и испытуемыми группами не было (р>0,05).

Искусственная инкубация эмбрионов осуществлялась в инкубаторе универсальном выводном (ИУФ-Ф-15, «Пятигорсксельмаш»).

Все испытуемые эмбрионы были разделены на пять групп: интактный контроль, контроль с введением 0,1мл дистиллированной воды и три опытные группы (I, II, III), которым было введено – по 0,1мл водного раствора  фуллеренола С60(ОН)24 , концентрации 1,5% , 3% и 4,5% , соответственно. Введение воды и растворов фуллеренола осуществлялось в воздушную камеру яйца в период формирования внутренних органов эмбриона.

Цыплята контрольных и опытных групп содержались раздельно, но в одинаковых условиях. Рацион питания был сбалансированным, а уход достаточным. В экспериментальных и контрольных группах выведенных цыплят в первые дни жизни, ежедневно в одно и то же время регистрировалась  прибавка в весе ( на электронных весах Model. Scout Pro SPU202, Max 400g, D = 0.01g).

Результаты и обсуждение

ИК- спектры   образцов С60(ОН)х(О)у и С60(ОН)x(О)у/Fe (рис.1)    типичны для смешанных фуллеренолов [9–11= 11-13 ]. широкая полоса поглощения с максимумом 3400 см-1 в области валентных колебаний ОН групп, относится к связям             –C–O–H,  характерные полосы  при  1080, 1370 и 1580 см-1  можно отнести  к   С-О, С-О-Н и С=C  связям, соответственно. Полоса с максимумом  поглощения  при 1720см-1 соответствует  колебаниям С=О групп,

Рисунок № 1.         ИК- спектры С60(ОН)х(О)у  и  С60(ОН)x(О)у/Fe

В образцах гидроксилированного фуллерена С60(ОН)х(О)у , полученных из FeФС присутствие  железа зарегистрировано по результатам  элементного анализа методом… Кроме того  в спектрах ЭПР образцов, снятых  при температурах 273 К и 77 К  (рис.2 а, б, в ) помимо радикальной линии (линия 1), характерной для фуллерена  [8 с.1093-1097]  наблюдается  линия 2, форма и положение которой характеризует присутствие в образце мельчайших (1-2 нм)  металлических частиц  [13]. В спектре фуллеренола полученного из ФС без железа такой линии нет (рис. 2в).  2

Рисунок № 2.  ЭПР-спектры. (Спектры  сняты  — Петраковской Э.А.-

   Красноярский институт физики им. Л.В. Киренского СО РАН.) 

В спектрах  ЭПР фуллеренола, С60 (ОН)х Оy / Fe наблюдается также линия 3 (усиливается при охлаждении), которую можно отнести к парамагнитному комплексу железа c фуллеренолом.

По данным  [10, с.93] фотоэлектронной спектроскопии (ФЭС). (рисунок №3) видно, что углерод в фуллереноле С60(ОН)х(О)у  (х+y = 24-26) находится в трех состояниях окисления, с энергиями связи электрона в атоме 282,9, 284,8 и 286,7 эВ, соответствующих неокисленному углероду, углероду, связанному с ОН-группой (С-OH), углероду, связанному с кислородом (C=O). Среднее число ОН-групп, определенное из соотношения числа окисленных атомов углерода к общему их числу, составляет 18,  число групп  С=О соответствует 6-8, железо не зарегистрировано, видимо, из-за малого содержания.

Рисунок № 3.  ФЭС образца С60(ОН)х(О)у

Энергодисперсионные рентгеновские спектры рисунок № 4  и таблицы № 1 и 2   демонстрируют то, что образцы  фуллеренолов С60(ОН)x(О)у/Fe и С60С70(ОН)x(О)у/Fe помимо углерода и кислорода  содержат 2,02 и  1,17 % железа, соответственно.

 Таблица № 1.Энергодисперсионные спектры.

Элемент

Весовой %

Атомный%

C K

50.42

58.25

O K

47.55

41.24

Fe K

2.02

0.50

  Таблица № 2. Энергодисперсионные спектры.

Элемент

Весовой %

Атомный%

C K

50.69

58.21

O K

48.14

41.51

Fe K

1.17

0.29

 С60(ОН)х(О)у /Fe

 С60,70(ОН)х(О)у /Fe

Рисунок  № 4 а , б.

Влияние фуллеренола С60 ( ОН) х (О)у на  развитие куриного эмбриона

Очевидно,  что при введении фуллеренола в организм потенциальные эффекты могут быть опосредованы как иммунным ответом на собственно фуллеренол (или его соединение) ,  так и на неоэпитоп(ы),  возникающие,  например,  при комплектовании фуллерена с белками или другими биомолекулами организма.

Преобладающее значение в компенсации нарушений полезного результата (ФСМП) функциональной системы: мать-плод, принадлежит организму матери, но плод также способен в определенных пределах участвовать в этих реакциях . В настоящей работе нами исследовано влияние фуллеренолов С60 на культуру ткани куриного эмбриона,  с целью выявления защитных механизмов у эмбриона на стрессирующий  фактор  введения чужеродного вещества, обладающего выраженными антиоксидантными свойствами с последующим изучением особенностей возрастной динамики общего развития у цыплят.

Рисунок № 5  Ежедневный прирост веса цыплят в опыте с 4-го по 11день.

Анализ ежедневного прироста веса цыплят в интактной и экспериментальных группах позволяет думать, что повреждающий фактор (введение в воздушную камеру яйца,  как дистиллированной воды, так и растворов фуллеренола)  является стимулирующим в первую неделю жизни цыплят (рис.5). Дальнейшее наблюдение  за приростом веса цыплят показало более быстрый  набор 200 граммового веса    в опытных группах цыплят по сравнению  с группой интактного контроля. Наибольшим стимулирующим эффектом, по нашему наблюдению,  обладал 3% раствор фуллеренола  (200 г.  к 14 – му дню), наименьшим – 4,5% раствор (200 г.  к 21 – му дню).

Гистологическое исследование в разные периоды в течение 21 дня жизни цыплят в опытных и контрольных группах показало появление  патологических изменений  в печени цыплят опытных групп в виде гидропической или водяночной дистрофии гепатоцитов, Причем при меньшей дозе вводимого фуллеренола проявления  некроза гепатоцитов были более выражены.     Логично думать, что ожидаемым результатом было бы угнетение физического развития цыплят, мы же, как было показано,  наблюдали обратный эффект.  На сороковой день жизни  в опытных  группах цыплят, которым вводили растворы фуллеренола, отмечается незначительное расширение перисинусоидальных пространств по сравнению с группой контроля, которой вводили дистиллят (рис.7), при этом патологических изменений в печени у животных не выявлено.

На представленной фотографии (рис.6) в области 2 виден лейкоцитарный вал, ограничивающий зону некроза от не пораженной ткани печени, вызванный воспалением, т.е. защитной реакцией организма.

Известно, например, что повреждения спиртами, вызывает картину жировой дистрофии. В нашем случае, мы видим проявления  преходящей вакуольно — белковой  т.е. гидропической дистрофии.

Поскольку получение фуллеренов как и фуллеренола не исключает    возможность присутствие в них органических микропримесей,  избавление от которых является достаточно сложным процессом, более того  используемый в нашей работе образец фуллеренола С60(ОН)24 содержал  микропримесь  железа (~ 0,03%), поэтому можно считать, что отрицательные эффекты на уровне клетки,  являются следствием недостаточной очистки фуллеренола. Исходя из сказанного, можно думать о   цитотоксическом механизме некроза, который  вызван перекисным окислением липидов и  как следствие, некротической гибели клеток [3 С. 51-52].

Вопрос о роли фуллеренолов С60(ОН)х и железосодержащих  фуллеренолов  С60(ОН)36-38/Fe и С70(ОН)36-38/Fe , которые получены без использования токсичных органических растворителей [1, С. 386-388], в подавлении АФК или стимуляции образования АФК групп мы относим к предмету дальнейших исследований.

Рисунок №.6    Дистрофические изменения гепатоцитов в опыте у цыпленка на введение 1,5% раствора фуллеренола.1 — Область здоровой ткани;  2 — Зона лейкоцитарного вала; 3 – Зона некроза;

Рисунок № 7. Расширение перисинусоидальных пространств в печень опытных цыплят на 40 – й день жизни. (А) – Контроль + дистиллят;  (Б) – Введен 1,5 % р-р фуллеренола; (В) – Введен 4,5% р-р фуллеренола;-

(Б)и(В) Патологических изменений не обнаружено.

Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности железосодержащих фуллеренолов

Проведено исследование  противоопухолевой и антиметастатической активности фуллеренолов С60(ОН)х(О)у, С60(ОН)х(О)у /Fe (далее — C60/f) и    С70,60(ОН)(О)у (далее — C70,60/f) на мышах, пораженных  карциномой Эрлиха (КЭ – видоспецифичная злокачественная опухоль кожи мышей, проявляющая все типовые свойства: инвазивный рост,   изъязвление, метастазирование и др.)

Трансплантацию солидной опухоли — аденокарциномы Эрлиха — перевивали подкожно асцитической жидкостью.     Антиметастатический эффект оценивали по следующим показателям: процент животных с метастазами, среднее число поверхностных метастазов на одно животное, степень метастатического поражения органов в зависимости от количества и размера метастазов.

С целью изучения антибластомного эффекта являющийся результатом сложного взаимодействия опухоли с организмом было использовано 50 белых мышей, которым подкожно перевивалась карцинома Эрлиха (асцитической жидкостью, взятой от больных мышей). Спустя 28 суток, когда у всех животных появились признаки опухолевой инвазии, в течении трех недель подкожно трехкратно им вводился растворенный в дистиллированной воде фуллеренол в различной концентрации. Все животные были разделены на семь групп – одна контрольная и шесть опытных.

Таблица 3. Экспериментальное исследование на модели карциномы Эрлиха.

 Экспериментальные группы Условное обозначение групп Схема введения препаратов Сроки появления метастазов.
1 2 3 4
Интактный

контроль

(ИК) Препараты не вводили, опухолевые клетки перевивали 36 – е сутки
I группа (КЭ+С60/f — 1%) Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 1% раствора  С60/f 40 – е сутки
II группа (КЭ+С60/f — 0,5%) Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 0,5% раствора С60/f 38 – е сутки
III группа (КЭ+ С60/f — 0,25%) Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 0,25% раствора С60/f 37 — 38 – е сутки
IV группа (КЭ+С70.60/f — 1%) Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 1% раствора С70/f Метастазы только у одной мыши на 42 – е сутки и на 14 – е сутки после первичного введения.
V группа (КЭ+С70,60/f — 0,5%) Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 0,5% раствора С70/f 42 – 45 е сутки
  VI группа (КЭ+С70,60/f — 0,25%) Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 0,25% раствора С70/f 42 – 45 е сутки
VII группа (КЭ+

С60(OH)х(О)у

– 1%)

Опухолевые клетки перевивали подкожно + 3х кратное введение подкожное 1% раствора фуллеренола С60 (OH)24 39 – 40 е сутки

Как показали проведенные исследования, у мышей с аденокарциномой Эрлиха применение Fe-содержащих водорастворимых фуллеренолов разных концентраций не стимулирует развитие опухолевого процесса во всех исследуемых группах. Более того, при использовании 1% раствора Fe – содержащего фуллеренола С70,60(ОН)х(О)у (х+у =36-38)   отмечено достоверное (р<0,001) ингибирующее влияние на рост первичной опухоли: у животных этой группы масса опухоли уменьшилась в 1,3 раза по сравнению с контролем. Использование 0,25% и 0,5%  растворов данного вещества привело к уменьшению массы опухоли в 0,5 раз по сравнению с контролем. При использовании водорастворимого фуллеренола С60,  без металла достоверного влияния изучаемых препаратов на процесс роста и метастазирования аденокарциномы Эрлиха не обнаружено. Обращает на себя внимание тот факт, что при введении 1%-го раствора препарата С70,60/f   с высокой степенью достоверности отличались от контроля показатели процесса диссеминации опухоли: частота метастазирования составила 12,5% (p<0,001) против 100% в контроле.

Таким образом, наибольший интерес с точки зрения дальнейшего исследования ингибирующего действия на рост опухоли представляют водорастворимые фуллеренолы С70,60(ОН)х(О)у, содержащие в своем составе железо.

                                                     Выводы:

Фуллеренолы  обладают стимулирующим действием на растущую ткань и угнетающим – на опухолевую.

Взаимодействие  фуллеренола С60(ОН)24   с  эмбриональной тканью цыплят,  сопровождается   эмбриотоксическими нарушениями в виде транзиторной  белковой дистрофии гепатоцитов.

В опыте с карциномой мышей, Fe–содержащий фуллеренол С70(ОН)36-38

 проявляет ингибирующее влияние на рост первичной опухоли у животных.

В случае с ингибированием карциномы мышей наблюдалась прямо пропорциональная зависимость антибластомного эффекта от величины концентрации (большая концентрация – более выраженный эффект). В случае  с эмбриональным материалом – обратная зависимость (меньшая доза вызывала более выраженные изменения в печени и стимулирующее влияние на физическое развитие).

Список литературы:

1.Martin Roursgaard 1, Steen S. Poulsen 2, Christopher L Kepley 3,Maria Hammer1,

Gunnar D.Nielsen1 and Soren T.Larsen 1 Polyhydroxylated C60 (Fullerenol) Attenuates Neutrphilic Lung  Inflammation in Mice Journal compilation @ 2008 Nordic Pharmacological Society. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,   103, 386-388

2.Пиотровский Л.Б.,Киселев О.И. Фуллерены в биологии.СПб.Росток,2006.335с.

  1. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия,-Москва, 1995.-С. 51-52.

4 Juan Li, Mingyi Zhang, Baoyun Sun, Gengmei Xing, Yan Song, HaiLi Guo,Yanan Chang, Yonghui Ge, Yuliang Zhao. Separation and purification of fullerenols for improvedBiocompatibility.// Carbon 50 (2012) 460-469.

5 Angelina T. Georgieva• Vijay Pappu• Vijay Krishna• Pando G. Georgiev•Ion Ghiviriga• Paul Indeglia• Xin Xu• Z. Hugh Fan• Ben Koopman•Panos M. Pardalos• Brij Moudgil. Polyhydroxy fullerenes// J Nanopart Res (2013) 15:1690DOI 10.1007/s11051-013-1690-6 ; 

6 Tzu-Chiao Chao, Guixue Song, Nicole Hansmeier, Paul Westerhoff, Pierre Herckes, and Rolf U. Halden. Characterization and LC-MS/MS based quantification of hydroxylated fullerenes //Anal Chem. 2011 March 1; 83(5): 1777–1783. doi:10.1021/ac1031379].

7  INORGANIC SYNTHESIS AND INDUSTRIAL INORGANIC CHEMISTRY Solubility and Some Properties of Aqueous Solutions of Fullerenol-d and Composition of Crystal Hydrates K. N. Semenova, D. G. Letenkoc, N. A. Charykovb, V. A. Nikitinc, M. Yu. Matuzenkod, V. A. Keskinovb,

8 Исакова В.Г., Гончарова Е.А., Петраковская Э.А.,  Баюков О.А., Чурилов Г.Н. Гидроксилирование  фуллеренолов моделированными наночастицами железа. Журнал прикладная химия 2011г. Т.84 выпуск 7 с.1093-1097

9.Осипова И.В., Глущенко Г.А., Исакова В.Г., Гончарова Е.А. и др. Исследование наночастиц со структурой металлическое ядро — углеродная оболочка, образующихся при плазмохимическом синтезе в высокочастотном дуговом разряде // Журнал Сибирского федерального университета. Серия: Химия. – 2011. – Т.4 – Вып. 3. – С. 294-300. 

10 Е. А Гончарова, В. Г. Исакова, Е. В. Томашевич, Г. Н. Чурилов // Вестник СибГАУ. – 2009. – В. 1(22). – С. 90-93 Получение водорастворимых полигидроксилированных фуллеренов с использованием наночастиц железа в качестве катализатора .

11  Xing GM, Zhang J, Zhao YL, Tang J, Zhang B, Gao XF, et al. Influences of structural properties on stability of fullerenols. JPhys Chem B2004;108(31):11473–9.

12  Kokubo K, Matsubayashi K, Tategaki H, Takada H, Oshima T. Facile synthesis of highly water-soluble fullerenes more than half-covered by hydroxyl groups. Acs Nano 2008;2(2):327–33.

13  Chiang LY, Bhonsle JB, Wang LY, Shu SF, Chang TM, Hwu JR.Efficient one-flask synthesis of water-soluble [60] fullerenols. Tetrahedron 1996;52(14):

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФУЛЛЕРЕНОЛА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНЬЮ
Статья посвящена изучению характера взаимодействия металлосодержащих фуллеренолов С60(ОН)24 с быстро растущей тканью патологического и нормального, эмбрионального происхождения.
Written by: Тригубчак Петр Николаевич, Исакова Виктория Гавриловна, Чурилов Григорий Николаевич, Гончарова Елена Александровна
Published by: БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА
Date Published: 01/09/2017
Edition: euroasia-science.ru_29-30.12.2015_12(21)
Available in: Ebook