30 Дек

СПІВВІДНОШЕННЯ ПРОЦЕСІВ СИНТЕЗУ ТА АПОПТОЗУ В НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПА ЩУРІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ЦУКРОВИМ ДІАБЕТОМ, УСКЛАДНЕНИМ ГОСТРИМ ПОРУШЕННЯМ КРОВООБІГУ В БАСЕЙНІ СОННИХ АРТЕРІЙ




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

Оскільки цукровий діабет (ЦД) – визнаний чинник ризику виникнення інсультів [4, 5], дослідження фундаментальних механізмів даного явища є предметом уваги як патофізіологів, так і клініцистів. Незважаючи на значну поширеність такої поєднаної патології на сьогоднішній день кількість досліджень її патогенезу обмежена, що мотивує актуальність робіт даного спрямування.

Мета роботи – вивчити динаміку співвідношення умісту клітинної РНК та білка р53 у клітинах полів гіпокампа щурів із ЦД, ускладненим каротидною ішемією-реперфузією.

Цукровий діабет (ЦД) відтворювали внутрішньочеревним уведенням стрептозотоцину (Sigma, Aldrich, США, 60 мг/кг маси) білим нелінійним самцям щурів віком два міс. [3]. Двобічну каротидну ішемію-реперфузію моделювали кліпсуванням обох загальних сонних артерій протягом 20 хв. [1] у шестимісячних щурів із ЦД (т.ч. тривалість діабету становила 4 міс.) і контрольних тварин того ж віку. Ранні наслідки ішемічно-реперфузійного пошкодження гіпокампа вивчали через одну год. від початку реперфузії, а відстрочені – на 12-ту добу після моделювання ішемії.

Після декапітації тварин на холоді швидко забирали головний мозок і користуючись координатами стереотаксичного атласу [7] виділяли поля гіпокампа СА1, СА2, СА3 та СА4 і забрані взірці фіксували в 10 % розчині Буена впродовж 24 годин. Здійснювали стандартну гістологічну проводку, після чого препарати заливали в парафінові блоки, з яких готували серійні зрізи товщиною 5-6 мкм. Зрізи депарафінували, регідрували в низхідних концентраціях етанолу. Для виявлення РНК їх фарбували галлоцианін-хромовими галунами за Ейнарсоном [2]. У нейронах забраних структур мозку визначали сумарний уміст, концентрацію (в одиницях оптичної щільності, ООЩ) та дисперсію розподілу РНК денситометричним методом.

Білок р53 виявляли методом імунофлуоресценції. Регідровані зрізи гіпокампа впродовж 18 год. інкубували у вологій камері при 4о С з первинними кролячими моноклональними антитілами до р53 щура та мишачими моноклональними антитілами до CD4 щура (Beckman Coulter, США), кон’югованими з FITC, промивали 0,1 М фосфатним буфером і заключали в суміш гліцерину та фосфатного буфера (9:1) для наступної люмінесцентної мікроскопії. Р53+-клітини гіпокампа ідентифікували за допомогою флуоресцентного мікроскопа Axioskop. Зображення вводили в комп’ютерну систему цифрового аналізу VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) [6]. Статистичну значимість відмінностей оцінювали за t-критерієм Стьюдента для незалежних виборок. Дані представлені у вигляді середніх арифметичних та стандартного відхилення.

Результати дослідження представлені в табл. 1,2.


Таблиця 1

Динаміка змін умісту РНК (од. оптичної щільності) у полях гіпокампа щурів із цукровим діабетом за умов ішемічно-реперфузійного пошкодження головного мозку (М±m)

Група cпостереження Нейрони
Уміст РНК на 1 мкм2 Сумарний уміст РНК

Поле СА1

Контроль 0,133±0,002 14,64±0,24
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,143±0,003* 17,80±0,448*
Ішемія-реперфузія (12 діб) 0,290±0,002*^ 27,26±0,25*^
Діабет 0,148±0,002* 13,99±0,26
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,170±0,003# 16,39±0,26#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб) 0,210±0,003#& 19,33±0,27#&

Поле СА2

Контроль 0,119±0,001 12,31±0,11
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,168±0,002* 15,92±0,27*
Ішемія-реперфузія (12 діб) 0,224±0,003*^ 21,85±0,29*^
Діабет 0,161±0,002* 16,35±0,22*
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,109±0,002# 11,69±0,21#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб) 0,189±0,002#& 20,32±0,27#&

Поле СА3

Контроль 0,087±0,002 10,67±0,20
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,153±0,002* 19,30±0,34*
Ішемія-реперфузія (12 діб) 0,253±0,002*^ 31,62±0,34*^
Діабет 0,131±0,002* 17,01±0,24*
Діабет та ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,158±0,004# 20,03±0,45#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб) 0,194±0,002#& 26,24±0,33#&

Поле СА4

Контроль 0,150±0,001 12,57±0,12
Ішемія-реперфузія (20 хв / 1 год) 0,196±0,002* 16,83±0,16*
Ішемія-реперфузія (12 діб) 0,445±0,004*^ 34,48±0,29*^
Діабет 0,186±0,001* 15,96±0,12*
Діабет та ішемія-реперфузія

(20 хв / 1 год)

0,213±0,002# 17,80±0,18#
Діабет та ішемія-реперфузія (12 діб) 0,305±0,002#& 24,76±0,18#&

Примітка: тут та в наступній табл. — вірогідність різниці порівняно з: * — контролем; ^ — ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у контрольних тварин; # — діабетом; & – ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у тварин із діабетом.

У щурів без ЦД 20-хвилинна ішемія/одногодинна реперфузія підвищила сумарний уміст та концентрацію клітинної РНК в усіх досліджених полях гіпокампа. На 12-ту добу вміст і концентрація РНК продовжували зростати. Чотиримісячний ЦД підвищив концентрацію і сумарний уміст РНК у нейронах усіх полів гіпокампа, за винятком поля СА4, де відбулося зниження цих показників. У щурів із ЦД 20-хвилинна ішемія з одногодинною реперфузією збільшила концентрацію та загальний уміст клітинної РНК у нейронах полів СА1, СА3 та СА4 і знизила – в полі СА2. Однак на 12-ту добу постішемічного періоду в нейронах усіх полів гіпокампа тварин із ЦД дані параметри зросли як щодо контролю, так і стосовно показників за раннього терміну спостереження.

Як демонструють дані табл. 2, у тварин без ЦД після 20-хвилинної ішемії/одногодинної реперфузії в усіх полях гіпокампа мала місце активація р53-залежних проапоптичних процесів, кількісно найсуттєвіша в полях СА1 та СА4. На 12-ту добу постішемічного періоду проапоптична активність стосовно контролю в полях СА1, СА2, СА3 залишалася підвищеною, а в полі СА4 – поверталася до рівня тварин контрольної групи. Чотиримісячний ЦД активував р53-залежні проапоптичні механізми в полях СА1, СА3, СА4; у тварин цієї експериментальної групи в ранньому постішемічному періоді активність р53-залежних проапоптичних процесів у полях СА1, СА3, СА4 достовірно перевищувала таку в щурів з аналогічним втручанням без діабету, а в полі СА2 була суттєво нижчою.

На 12-ту добу в щурів із діабетом активність р53-проапоптичних процесів стосовно показників за ЦД без порушення церебрального кровообігу в полі СА1 залишалася підвищеною, в полі СА2 поверталася до рівня в щурів із діабетом, а в полях СА3 та СА4 – знижувалася.

Таким чином, активація в контрольних щурів проапоптичних процесів у ранньому постішемічному періоді супроводжувалася посиленням синтетичних, про що свідчило зростання вмісту РНК. На 12-ту добу спостереження наростання вмісту РНК відбувалося на тлі відсутності динаміки проапоптичної активності. Ймовірно, можна думати про компенсаторну активацію процесів синтезу в клітинах, що вижили після ішемії.


Таблиця 2

Вплив ішемії-реперфузії на реакцію р53+

клітин полів гіпокампа контрольних щурів та тварин із цукровим дiабетом (М ± m)

Група спостереження Концентрація білка р53 ЕІФ Площа ІРМ на

10 000 мкм2

Питомий уміст білка р53 ЕІФ
Контроль 0,0041±0,0004 220,023±26,032 0,890±0,195
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0044±0,0003 435,478±44,637* 1,851±0,178*
Ішемія-реперфузія 12 діб 0,0049±0,0005 441,657±45,205* 2,120±0,208*
Діабет 0,0037±0,0003 398,466±34,397* 1,286±0,126
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0040±0,0004 916,525±62,99#

р2<0,001

3,521±0,368#

р2<0,001

Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб 0,0048±0,0004 632,022±59,983#& 2,928±0,227#

Поле СА2

Контроль 0,0036±0,0002 625,076±57,356 1,951±0,241
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0104±0,0009* 800,043±69,727* 8,464±3,985*
Ішемія-реперфузія 12 діб 0,0042±0,0004^ 643,521±64,603 2,647±0,229*^
Діабет 0,0040±0,0003 699,684±61,109 2,283±0,200
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0047±0,0005 732,827±73,878 3,321±0,361#
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб 0,0044±0,0004 563,737±55,519& 2,064±0,311&

Поле СА3

Контроль 0,0042±0,0002 336,359±32,509 1,307±0,130
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0041±0,0001 586,773±54,216* 2,270±0,222*
Ішемія-реперфузія 12 діб 0,0037±0,0001*^ 461,571±44,328* 1,674±0,139*^
Діабет 0,0031±0,0001* 663,05±67,461* 1,981±0,195*
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0033±0,0002 955,43±97,43# 2,468±0,207
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб 0,0038±0,0003# 581,898±58,612#& 1,976±0,143&

Поле СА4

Контроль 0,0041±0,0002 363,499±43,946 1,369±0,131
Ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0044±0,0002 701,116±73,506* 2,864±0,243*
Ішемія-реперфузія 12 діб 0,0037±0,0001 424,165±49,632^ 1,497±0,273^
Діабет 0,0037±0,0007 510,595±52,065* 1,484±0,223
Діабет та ішемія-реперфузія 20 хв / 1 год 0,0029±0,0001 892,845±87,274# 2,386±0,208#
Діабет та ішемія-реперфузія 12 діб 0,0033±0,0001& 373,018±39,544#& 1,185±0,246&

Примітка: вірогідність різниці порівняно з: * — контролем; ^ — ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у контрольних тварин; # — діабетом; & – ішемією-реперфузією (20 хв / 1 год) у тварин із діабетом.

Незважаючи на те, що в щурів із ЦД в обидва терміни постішемічного періоду вміст РНК зростав на тлі посилення проапоптичної активності, це зростання, особливо в пізньому терміні спостереження, за абсолютними показниками було значно меншим, ніж у тварин без ЦД.

Висновок. У тварин без діабету активація проапоптичної активності у відповідь на ішемію-реперфузію супроводжується паралельним зростанням процесів синтезу в клітинах гіпокампа. За умов діабету в пізньому постішемічному періоді активність процесів синтезу значно нижча, ніж процесів апоптозу.

Список літератури:

  1. Скибо Г.Н. Использование различных экспериментальных моделей для изучения клеточных механизмов ишемического поражения мозга / Г.Н.Скибо // Патология. – 2004. – Т.1, №1. – С. 22-30.
  2. Пирс Э. Гистохимия / Э. Пирс М.: Изд-во ин. лит, 1962. – 962 с.
  3. Ткачук С.С. Експресія білків Hif-1α, р53 та Bcl-2 в головному мозку за умов двобічної каротидної ішемії-реперфузії на тлі цукрового діабету в самців-щурів / С.С. Ткачук, О.М. Лєньков // Клінічна та експериментальна патологія. – 2010. – Т.ІХ, №2(32). – С.111–113.
  4. Diabetes mellitus: a risk factor for ischemic stroke in a large biracial population / C. Khoury, D. Kleindorfer, K. Alwell [et al.] // Stroke. – 2013. – Vol.44, №6. – Р. 1500-1504.
  5. Identifying Target Risk Factors Using Population Attributable Risks of Ischemic Stroke by Age and Sex /H. Park, Y. Ko, S.J. Lee [et al.] // J. Stroke. – 2015. – Vol.17, №3. – Р. 302-311.
  6. Kolesnik Y.M. Image analysis system for quantitative immunofluorescence measurement / Y.M. Kolesnik, A.V. Abramov // Microscopy and Analysis. – 2002. – № 5. – P. 12–16.
  7. Kоnig J. F. The rat brain. A stereotaxis atlas of forebrain and lower part of the brain stem / J. F. Kоnig, P. A. Klippel. – Baltimora: The Williams and Wilkins Company, 1963.– 162 p.
    СПІВВІДНОШЕННЯ ПРОЦЕСІВ СИНТЕЗУ ТА АПОПТОЗУ В НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПА ЩУРІВ З ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ЦУКРОВИМ ДІАБЕТОМ, УСКЛАДНЕНИМ ГОСТРИМ ПОРУШЕННЯМ КРОВООБІГУ В БАСЕЙНІ СОННИХ АРТЕРІЙ
    Цель – изучить динамику соотношения содержания клеточной РНК и белка р53 в нейронах полей гиппокампа крыс с сахарным диабетом, осложненным каротидной ишемией-реперфузией. Исследование выполнено на крысах со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, осложненным 20-минутной окклюзией обеих сонных артерий. Содержание белка р53 определяли методом иммунофлуоресценции, РНК – денситометрическим методом после 20-минутной ишемии с одночасовой реперфузией и на 12-е сутки постишемического периода в полях гиппокампа СА1, СА2, СА3, СА4. У животных без диабета активация проапоптотической активности в ответ на ишемию-реперфузию сопровождается параллельным возрастанием процессов синтеза в клетках гиппокампа. В условиях диабета в позднем постишемическом периоде активность процессов синтеза значительно ниже, чем процессов апоптоза. Выводы: Сахарный диабет модифицирует соотношение процессов синтеза и апоптоза в клетках гиппокампа в ответ на ишемически-реперфузионное повреждение.
    Written by: Ніка Ольга Михайлівна
    Published by: БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА
    Date Published: 01/13/2017
    Edition: ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_30.12.16_33(2)
    Available in: Ebook