28 Ноя

Роль стафилококков в полости рта в биодеструкции съемных протезов




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

Цель исследования: с помощью метода сканирующей электронной микроскопии провести сравнительный   анализ взаимодействия S. aures с поверхностью неметаллических компонентов съемных зубных протезов и оценить протективные свойства покрытия карбида кремния на них в отношении данного микроорганизма.

Материалы и методы:

В работе были использованы образцы пластмасс полиуретан «Денталур» (ОАО НИИР Россия), «Фторакс», «Пластмасса бесцветная» («АО Стома, Украина), акриловый материал «Acry-Free», «Quattro Ti» (Италия), силикон «Molloplast-В» (Германия).  Кроме этого были исследованы образцы «Фторакс» и силикона с покрытием карбидом кремния.

Все образцы пластмасс размером 1см2  были проинкубированы с S.aureus (клиническим изолятом, выделенным из ротовой полости больного с парадонтитом, и референсным штаммом S.aureus ATTC 29213) в чашках Петри с жидкой питательной средой Luria-Bertani, в течение 48 час и 7 суток  и 1,5 мес. при t-37оС в термостате.

Образцы «Фторакс» без покрытия карбидом кремния и вместе с ним, были также проинкубированы в течение 7 суток в питательном бульоне, в который было внесено 1 мл слюны пациента, у которого предварительно был выявлен S. epidermidis.

После инкубации образцы были фиксированы в 10% растворе формалина, высушены при комнатной температуре и помещены на специальные алюминиевые столики с помощью карбонового скотча. Далее образцы были ныпылены слоем золота толщиной 5 нм и исследованы в двулучевом сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company USA) при ускоряющих напряжениях 5 и 10 kV в режимах низкого и высокого вакуума.

Результаты

На сроке 48 час, после инкубации с референсным штаммом S.aureus ATTC 29213, на поверхности всех изученных пластмасс, включая «Фторакс» и силикон с покрытием карбидом кремния, были обнаружены адгезированные одиночно лежащие стафилококки и сформированные ими микроколонии.  Максимальное скопление бактерии наблюдалось по периферии образцов и в области механических повреждений (царапин, сколов, углублений на поверхности). (Рис.1)

Рис.1 «Денталур» 24 час инкубации: а – адгезированные стафилококки;       48 час инкубации: б – образование микроколоний;  7 суток инкубации: в – увеличение биомассы стафилококков на поверхности, г – образование массивной биопленки. Ув. 20 000.

С увеличением срока инкубации количество бактерий на поверхности всех изученных образцов увеличивалось. К 7 суткам инкубации наиболее выраженная многослойная с отчетливым экзополиматриксом биопленка формировалась на поверхности «Денталура» и «Бесцветной пластмассы», «Quattro Ti» и «Acry-Free», в то время как на поверхности «Фторакс» и силикон выявлялись участки с одиночными адгезированными бактериями и микроколониями (Рис. 2, 3).

Рис.3. Инкубация 7 суток. Адгезированные стафилококки на поверхности ↑:  а — «Фторакс», б — силик он.  Ув. 20 000

На поверхности образцов базисных пластмасс («Денталур», «Acry-Free», силикон, «Фторакс», «Бесцветная пластмасса») с покрытием карбидом кремния после инкубации со стафилококком существенно уменьшалось количество адгезированных бактерии, микроколоний и биопленок по сравнению с необработанными материалами (Рис.4).

Рис.4.  Инкубация со стафилококком в течение 7 сут: а – биопленка ↑ на поверхности «Денталур» с покрытием карбидом кремния.  Единичные адгезированные бактерии ↑ на поверхностях с покрытием карбидом кремния: б — «Acry-Free», в — силикон, г — «Фторакс». Ув. 20 000.

В то же время, обработанные карбидом кремния образцы пластмассы «Quattro Ti» после инкубации со стафилококком в течение 7 дней, интенсивно колонизировались стафилококком. Бактерии образовывали биопленку и разрушали поверхность материала (Рис.5).

Рис. 5. «Quattro Ti» с покрытием карбидом кремния после инкубации со стафилококком в течение 7 сут. Дефекты поверхности ↑.

Дефекты поверхности пластмасс, в областях сформированной биопленки выявлялись на поверхности «Денталур», «Бесцветная пластмасса» и в отдельных участках на поверхности «Фторакс», а также на поверхности «Quattro Ti» без покрытия карбидом кремния и с ним (Рис. 2,5).   Дефектов поверхности силикон без покрытия, силикон и «Фторакс» с покрытием карбидом кремния выявлено не было.

Следует отметить, что в случае, когда покрытие карбидом кремния было неравномерным или имело дефекты прилежания к пластмассе («Фторакс», силикон, «Acry-Free»), стафилококки колонизировали именно эти области и инициировали процесс разрушения на свободной от покрытия поверхности пластмассы (Рис.6).

 Рис.6 Колонизация стафилококком в области дефекта поверхности материалов с покрытием карбидом кремния: а — «Acry-Free» и б —  «Quattro Ti». Ув. 20 000.

В образцах, проинкубированных с клиническим изолятом S. aures наблюдалась картина, идентичная той, что была описана для стафилококка референсного штамма. Следует отметить, что в этом случае интенсивность колонизации и образования биопленки на поверхности всех изученных пластмасс была более выраженной.

При электронно-микроскопическом исследовании препаратов «Фторакс», проинкубированного   с совокупным микробиомом полости рта пациента, у которого был обнаружен S. epidermidis, было выявлено образование ярко выраженного налета, покрывавшего всю поверхность образца. По структуре поверхность налета была идентична поверхности экзополисахаридного матрикса, характерного для сформированных бактериальных биопленок. Только в отдельных участках можно было видеть контуры бактерий, которые также были покрыты слоем матрикса (Рис.7). Для того чтобы визуализовать собственно сами бактерии слой матрикса был удален трехкратным промыванием 96о этаном поверхности образца. После проведения этой процедуры при повторном микроскопировании было показано, что бактерии формировали смешанные биопленки по морфологическим характеристикам, относившиеся к четырем разным группам: кокки размером 400 до 600 нм, стрептококки размером от 600 нм до 1мкм, крупные округлые микроорганизмы размером от 1 до 2 мкм и палочковидные бактерии 500-600 нм.  В области биопленок происходило формирование дефектов поверхности «Фторакс» без покрытия.

Рис.7. 7 суток инкубации: образование бактериального налета на поверхности пластмасс без покрытия карбидом кремния — «Фторакс»             а –  обзор. Ув.55, б – фрагмент поверхности пластмассы, обведены участки биообрастания. Ув.4000.

 Рис. 8. Поверхность «Фторакс» без покрытия 7 суток инкубации.  а,б — биопленка, в — щелевидный  дефект пластмассы под биопленкой ↑.  Адгезированные бактерии и микроколонии: г — кокков, д – стрептококков, е — грибов.

Результаты:

Золотистые стафилококки способны колонизировать поверхность неметаллических (полимерных) материалов, используемых для изготовления съемных зубных протезов. Этапы взаимодействия с поверхностью искусственных материалов можно представить следующим образом: образование налета (безмикробного) одновременно с адгезией к поверхности отдельных бактериальных клеток, после адгезии бактерии делятся и образуют микроколонии, которые с увеличением срока инкубации увеличиваются в размерах и покрываются слоем экзоклеточного матрикса, то есть формируют биопленку. При образовании биопленки на поверхности изученных материалов появляются дефекты в виде трещин, регистрируется слущивание частиц с поверхности и крошковидный материал [1, 2, стр. 13].

По нашим данным клинические изоляты S.aureus и S.epidermidis по сравнению с референсным штаммом S.aureus ATTC 29213 более интенсивно колонизируют поверхности полимерных пластмасс и «Силикона». Возможной причиной этого вероятно является экспрессия белков-адгезинов и экзополисахаридного внеклеточного адгезина PIA клиническими изолятами стафилококка, поскольку для этих штаммов, обитающих в условиях агрессивной для них среды (организм человека) наличие этих факторов обеспечивает выживание популяции. Клинический изолят S. epidermidis успешно колонизирует поверхность «Фторакс» совместно с другими микроорганизмами, обитателями ротовой полости.

Сравнительный анализ структуры поверхности у различных материалов показал, что наиболее устойчивыми к биодеструкции, вызываемой стафилококками, является «Фторакс» и силикон. Устойчивость материала к биодеструкции определяется химическим составом материала, «Фторакс» содержит фтор, элемент который обладает антибактериальным эффектом. Как было показано ранее, распределение фтора в этом материале неравномерное. В тех участках поверхности, где регистрируется наличие фтора, не происходит адгезии микроорганизмов и соответственно ее разрушения [1, стр. 13].  Силикон состоит из кремнийорганического соединения, и, по-видимому, те органические компоненты, входящие в его состав, не разрушаются ферментами, кислотами или щелочами, продуцируемыми бактериями.

Полиуретан и полиметилметакрилатные (акрилы) смолы подвергаются стафилококковой биодеструкции, поскольку эфирные связи между мономерами у этих полимерных материалов могут расщепляться эстеразами, продуцируемых стафилококком, и в дополнении к этому, выделяемые в процессе жизнедеятельности бактериями кислоты реализуют процесс кислотного гидролиза тех же эфирных связей в полимерах [3, стр. 13].

Выводы: Учитывая это обстоятельство, актуальным является разработка специальных антибиодеструктивных покрытий полимерных пластмасс [4, стр. 13].  В данном исследовании были использованы покрытия на основе карбида кремния.  Несмотря на то, что стафилококки успешно адгезируются к поверхности покрытия и формируют микроколонии, ярко выраженной биопленки на их поверхности не образуется, что вероятно связано с тем, что бактерии не могу извлечь из материала, необходимый для синтеза экзоклеточного матрикса углерод.  Соответственно не происходит и разрушения поверхности с покрытием карбидом кремния, поскольку биодеструктивный потенциал стафилококков в данном случае не реализуется.

Следует отметить, что в целях улучшения качества покрытия карбидом кремния полимерных пластмасс необходимо строгое соблюдение технологии его нанесения, при которой будет соблюдаться равномерность его распределения по поверхности, будут отсутствовать какие-либо дефекты между покрытием и материалом пластмасс или силикона.

 Список литературы:

  1. Автандилов Г.А.  Биодеструкция зубных протезов из полимерных материалов (экспериментальное исследование) // Автореф. Дисс.канд.мед.наук. 2013 г. 24 с.
  1. Автандилов Г.А. Ультраструктурное исследование процесса взаимодействия Staphylococcus aureus с полиуретаном // Dental forum. – 2011. — №3. – С. 11-12.
  1.  Didenko L.V. Avtandilov G.A., Shevlyagina N.V., Smirnova T.A., Lebedenko I.Y., Tatti F., Savoia C., Evans G. and Milani M. Biodestruction of polyurethane by Staphylococcus aureus (an investigation by SEM, TEM and FIB) //Current microscopy contributions to advances in science and technology, A. Méndez-Vilas (Ed.), Microscopy Series №5;V.1, p. 323-334
  1. Воронов И.А., Митрофанова Е.А., Калинин А.Л., Семакин С.Б., Диденко Л.В., Автандилов Г.А. Разработка нового покрытия из карбида кремния для защиты зубных протезов от биодеструкции // Российский стоматологический журнал. – 2014.- №1.-С.4-9
    . Силикон состоит из кремнийорганического соединения, и, по-видимому, те органические компоненты, входящие в его состав, не разрушаются ферментами, кислотами или щелочами, продуцируемыми бактериями.» author=»Воронов Игорь Анатольевич, Автандилов Георгий Александрович» publisher=»БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА» pubdate=»2017-01-19″ edition=»ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_28.11.15_11(20)» ebook=»yes» ]