30 Дек

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОДЕИНА ФОСФАТА В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЯХ РОДОКОККОВ




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

настоящее время в сточных, природных водах и даже питьевой воде все чаще обнаруживаются лекарственные средства и продукты их разложения [1]. Так, в 2011 году в водных источниках Германии впервые был обнаружен  кодеин [2]. В связи с этим актуальной аналитической задачей является разработка способов детектирования фармполлютантов и их метаболитов в объектах окружающей среды. В последние годы показано, что эффективными биодеструкторами фарполлютантов и кодеина, в частности, являются актинобактерии рода Rhodococcus, которые относятся к обычным компонентам техногенно-загрязненных сред [3]. Поскольку пробы сточных и природных вод представляют собой, как правило, многокомпонентные смеси, то наиболее рациональным методом определения в них лекарственных средств является высокоэффективная жидкостная хроматография.

В связи с этим, в настоящей работе приводятся условия количественного определения кодеина фосфата (КФ) в постферментационной среде культивирования родококков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также результаты исследования динамики процесса биодеструкции КФ штаммом R. rhodochrous ИЭГМ 647 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур (WFCC) #768, www.iegm.ru/iegmcol), изолированным из нефтезагрязненной воды [3].

Анализ образцов культуральной жидкости выполняли на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» («Эконова», Россия) со спектрофотометрическим детектором и металлической хроматографической колонкой (2×75 мм), упакованной обращенно – фазным сорбентом ProntoSIL-120-5-C18 AQ (размер зерен 5 мкм). Регистрацию и обработку хроматографической информации осуществляли с помощью программы «Мультихром» (ЗАО «Амперсенд», Москва).

При разработке методики хроматографического определения КФ в культуральной жидкости родококков использовали 0,004% раствор КФ в фосфатном буферном растворе состава (г/л) Na2HPO4-8,9; KH2PO4-3,39 (рН 7,0), а также фосфатный буферный раствор, полученный при культивировании родоккков in vitro, и содержащий КФ, его метаболиты и продукты жизнедеятельности бактериальных клеток.

Пробы культуральных жидкостей в количестве 1 мл центрифугировали при 12000 об/мин в течение 3 мин («Mini Spin», Германия). Для анализа проб использовали 10 мкл надосадочной жидкости.

Идентификацию КФ на хроматограммах проводили по времени удерживания и спектральным соотношениям, полученным при многоволновом детектировании, в сравнении с 0,004% раствором КФ в среде фосфатного буфера.

На рис. 1 представлены хроматограммы раствора стандартного образца КФ (0,004%) в фосфатном буферном растворе (А) и КФ в культуральной жидкости после 30 сут процесса биодеструкции.

Рис. 1. Хроматограммы КФ в фосфатном буферном растворе (А) и КФ в фосфатном буферном растворе после 30 сут ферментации (Б).

При сравнении хроматограмм наблюдается совпадение пиков КФ и одинаковое время удерживания КФ (5,23 ± 0,02 мин).

Таким образом, для разделения образующейся в процессе биодеструкции КФ многокомпонентной системы предложены следующие условия хроматографического анализа: подвижная фаза – 0,1% раствор трифторуксусной кислоты; скорость потока элюента – 100 мкл/мин; режим элюирования – градиентный; детектирование многоволновое — 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм; температура термостата колонки –40°С; объем вводимой пробы – 10 мкл.

Разработанная методика была использована для оценки содержания КФ в культуральной жидкости родококков в процессе биодеструкции КФ (табл. 1). Расчет содержания КФ в культуральных жидкостях проводили методом внешнего стандарта по площади хроматографических пиков относительно площади стандартного раствора КФ по формуле:

Cx =        SxCo

   So

где Cх  – концентрация КФ в культуральной жидкости; Сo– концентрация КФ в стандартном растворе; Sх– площадь хроматографического пика КФ в культуральной жидкости,Auмкл; So– площадь хроматографического пика КФ в стандартном растворе, Auмкл.

Таблица 1.

Изменение содержания кодеина фосфата в процессе биодеструкции клетками R. rhodochrous ИЭГМ 647

опыта

Содержание кодеина фосфата, %
0

сут

10

сут

20

сут

40

сут

60

сут

80

сут

90

сут

92

сут

Абиотич.

контроль

99,70

±1,45

99,81

±1,60

99,82

±1,45

99,78

±1,20

99,80

±1,30

99,79

±1,25

99,80

±1,30

99,69

±1,90

1 99,61

±1,10

80,81±1,60 75,11± 1,71 68,37±1,42 60,02±1,00 42,87±1,45 41,82±1,30 40,77±1,21
2 99,60

±1,30

84,10±1,20 70,72±1,45 60,30±1,77 8,20

±1,35

3,25

±1,45

1,01

±1,11

0

Примечание: абиотический контроль – стерильный раствор КФ в фосфатном буферном растворе; опыт 1 – фосфатный буферный раствор + R. rhodochrous ИЭГМ 647 + 0,0002 г сульфата железа (II) (дробное внесение кодеина); опыт 2 – фосфатный буферный раствор + R rhodochrous ИЭГМ 647 (дробное внесение кодеина и культуры).

Таким образом, разработанные условия хроматографического определения КФ позволяют контролировать его содержание в культуральной жидкости родококков в процессе биодеструкции КФ.

Список литературы:

  1. Nikolau A. Pharmaceuticals and related compounds as emerging pollutants in water: analytical aspects / Global NEST Journal. – 2013. – V. 15. – No 1. – P. 1–12.
  2. Wick A. Elucidation of the transformation pathway of the opium alkaloid codeine in biological wastewater treatment / A. Wick, M. Wagner, T.A. Ternes // Environmental Science & Technology. – 2011. – V.45. – P. 3374 – 3385.
  3. Catalogue of Strains Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. List of Species and of IEGM Collection. 2014 [Электронный ресурс] URL: http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/ (дата обращения 25.12.2014).
    ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОДЕИНА ФОСФАТА В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЯХ РОДОКОККОВ
    Written by: Плотников Александр Николаевич
    Published by: БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА
    Date Published: 06/16/2017
    Edition: ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_ 30.12.2014_12(09)
    Available in: Ebook