25 Июл

ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СЫРЬЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

На сегодняшний день проблема угнетающего воздействия антибиотиков на организм человека стоит достаточно остро[6 с. 599-609]. Кроме того, мировой опыт показывает, что скорость развития антибиотикорезистентности у микроорганизмов превышает скорость создания и исследования новых антибиотических веществ, в связи с чемнеобходим поиск альтернативных антибиотических средств с минимальными негативными эффектами [6 с. 599-609, 7 с. 202-206, 8 с. 150-154]. Исследования эндогенных антимикробных пептидов природного происхождения становятся основным направлением ввиду особых свойств данных соединений [2 с. 583-598, 4 с. 1337-1347]. Стоит отметить, что антимикробные пептиды, например, дефензины, являются основным фактором врожденного иммунитета, сохранившегося у растений, животных, грибов, в процессе эволюции [1 с. 31-40, 3 с. 211-215, 4 с. 1337-1347, 5 с. 4-5]. Они способны распознавать инфекционные агенты и обеспечивать защитную реакцию путем нарушения структуры или функции клеточной мембраны патогена [2 с. 583-598, 7 с. 202-206, 8 с. 150-154].

Материалы и методы

Объектами исследования являлись лиофильно высушенныеиндивидуальные экстракты слизистых оболочек свиней(ротовой полости, языка, пятачка, прямой кишки).

Для получения экстрактов сырье замораживали и измельчали на бытовой электрической мясорубке. Экстракцию проводили на лабораторной диспергирующей установке (Россия)при постоянном перемешивании в течение 24 часов, со скоростью 300 об/мин при соотношении объемов экстрагируемой ткани и раствора натрия хлорида (0,9 %) 1:2 при температуре 4-5 оС. Полученные экстракты центрифугировали при 3500 об/мин в течение 8 мин, отобиралинадосадочную жидкость и проводили ультрафильтрацию на установке VivaFlow200 (Германия), при этом экстракты разделяли на три фракции по соответствующим молекулярным массам: ˃5 кДа; 5-30 кДа; 30<кДа.Последующую вакуумную сушку осуществляли при температуре -40-42оС, давлении 3,8-4 Па на лабораторной лиофильной сушке (Россия).

Анализ белково-пептидного состава выполняли методом электрофореза в полиакриламидном геле 18 % плотности в присутствии 0,1 % лаурилсульфата натрия на предварительно подготовленных образцах с концентрацией 0,5 мг/мл и 0,6 мг/мл в буфере для разведения. В качестве свидетелей использовали маркер, состоящий из одиннадцати стандартов с молекулярной массой 250, 150, 100, 70, 50, 40, 30, 20, 15, 10 и 5 кДа («Fermentas», Литва).

Антибактериальную активность определяли микробиологическим диско- диффузионным методом:в чашки Петри на поверхность агара газоном высевали культуры Еsherihiacoli и Proteusvulgaris, затем на агарвыкладывали диски, смоченные разведенными лиофилизатами(концентрации: 0,1 г/мл, 0,05 г/мл, 0,025 г/мл, 0,012 г/мл). Диффузия экстракта в агар приводила к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. Чашки Петри с посевами ставили в термостат (температура 37 оС), через 20 и 40 часов замеряли зоны подавления роста культур (Рисунок 1).

1 — зона подавления роста микроорганизма вокруг диска с экстрактом, микроорганизм чувствителен к экстракту

2 — нет зоны подавления роста микроорганизма экстрактом, микроорганизм не устойчив к экстракту

3 — зона подавления роста микроорганизма вокруг диска с экстрактом, микроорганизм умеренно чувствителен к экстракту

Рис. 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско- диффузионным методом.

Результаты исследования

Анализ электрофореграмм в 18 % полиакриламидном геле показал, что в экстракты являютсямногокомпонентными смесями, содержащими белки в широком диапазоне молекулярных масс (выявлено большое количество как высокомолекулярных, так и низкомолекулярных соединений, при этом экстракты слизистых тканей органов достаточно индивидуальны(Рисунок 2).

 

  Условные обозначения:

Ст — Маркеры молекулярной массы (250, 150, 100, 70, 50, 40, 30, 20, 15, 10 и 5 кДа)

1- экстракт слизистой оболочки языка

2- экстракт слизистой оболочки ротовой полости

3-экстракт слизистой оболочки носовой полости

4- экстракт слизистой оболочки ануса

 

Рисунок 2. Электрофореграмма исследуемых образцов

Анализ электрофоретических исследований экстракта слизистой оболочки языка (трек 1)выявил 28 полос: четкие белковые зоны обнаружены в диапазонах 13-14, 28-29, 38-39, 43-45, 56-70, 85-86 кДа; минорные белковые зоны 17-18 кДа, 20-21 кДа, 21-22 кДа, 22-23 кДа. Также было получено детальное разделение низкомолекулярных белковых зон – четко прослеживаются полосы в диапазоне от 2 до 6, 11-12, 14-15 и 16 кДа), в диапазоне от 18 до 54 кДа проявились минорные зоны (31, 32-33, 52-53, 54-55 кДа). Отмечено появление четкой полосы, соответствующей молекулярной массе 100-101 кДа.

При анализе электрофореза экстракта слизистой оболочки ротовой полости (трек 2)и экстракта слизистой оболочки носовой полости (трек 3)обнаружено 30 полос. При этом на треке 2показано присутствие четких белковых зон в области 11-12, 13-14, 26-27, 34-35, 35-36, 38-39, 41-42, 100-101 кДа; минорных белковых зон в диапазонах 16-17 и 21-22 кДа. Выявлено детальное разделение минорных зон в диапазоне 17-18, 20-21, 29-30 и 49-50 кДа; четких зон в области 25-26, 28-29, 30-31, 32-33, 43-45, 47-48 и 149-150 кДа. На треке 3 присутствуют четкие белковые зоны в диапазонах 26-27, 28-29, 34-35, 35-36 и 39-40 кДа; минорные белковые зоны в области 24-25 и 25-26 кДа. Отчетливо проявились минорные зоны в области 23-24, 45-4 и 96-97 кДа; ярковыражены полосы в диапазоне 12-13, 14, 19, 32-33, 36-37, 44-45, 47-48, 89-90 и 149-150 кДа.

При анализе электрофореза экстракта слизистой оболочки прямой кишки(трек 4) обнаружено 23 полосы: присутствуют полосы четкие белковые зоны в области 25-26, 28-29, 38-39, 54-55 и 100-101 кДа; детально проявились минорные зоны 14-15 кДа; четкие белковые зоны в диапазоне 12-13, 33-34, 120-121 и 150-151 кДа.

Сопоставление полученных с помощью электрофоретического исследования результатов с базой данных UniProt [9] позволил охарактеризовать белковые вещества, которые присутствуют в нативных экстрактах. Так, треки экстрактов слизистых оболочек, предположительно, включают в себя следующие соединения: Интегрин-бета (87 и 86 кДа), Бета-катенин (85 кДа), белок АМОТ (73 кДа), белок-рецептор серина/треонинкиназы(57, 58 и 60 кДа), полипиримидиновыйпутесвязывающий белок — 1 (60 кДа), белок FRS2 (57 кДа), белок UDP глюкозо-6-дегидрогеназы (55 кДа), МНС класса 1 антиген (40кДа), Бета-дефензин (4-17 кДа), белок UDP глюко-6-дегидрогеназы (5 кДа), белок MADH4 белок (4 кДа), белок NSD 1 (2 кДа) [9].

Определение антибактериальной активности показало, что в минимальной (0,012 г/л)и максимальной концентрации (0,1 г/л) подавление роста происходило более выраженно, чем в концентрациях 0,025 г/л и0,05 г/мл. При этом отмечена разная направленность действия: выявлено менее выраженное антимикробное действие при использовании экстрактов слизистой оболочки ротовой полости (Е. coliиP. Vulgaris), носовой полости и языка (Р. Vulgaris).Наиболее интенсивное подавление роста наблюдается у экстрактов слизистых ротовой, носовой полостей и языка в концентрации 0,1 г/мл при молекулярных массах менее 5 кДа и в диапазоне от 5 до 30 кДа, что подтверждает анализ электрофоретического исследования.

Таблица 1.

Антимикробные свойствалиофилизатов слизистых оболочек

Концентрация лиофилизата

Задержка зоны подавления роста, мм
Е. coli P. vulgaris
20 часов 40 часов 20 часов 40 часов
Слизистая оболочка ротовой полости (0,1 г/мл)
> 30 кДа 0,5 2 2,5
Слизистая оболочка ротовой полости (0,05 г/мл)
5 — 30 кДа 1,5 2 2
Слизистая оболочка ротовой полости (0,025 г/мл)
5 — 30 кДа 0,5 1
Слизистая оболочка ротовой полости (0,012 г/мл)
< 5 кДа 1,5 4,5
5 — 30 кДа 2 2
> 30 кДа 1 4
                Слизистая оболочка носовой полости (0,1 г/мл)
< 5 кДа 3 4 7
5 — 30 кДа 4,5
> 30 кДа 1 3 3
Слизистая оболочка носовой полости (0,05 г/мл)
< 5 кДа 2 2
> 30 кДа 2,2 2,2
Слизистая оболочка носовой полости (0,025 г/мл)
< 5 кДа 3 3 2
5 — 30 кДа 1,5 1,5
> 30 кДа 7,5 7,5
Слизистая оболочка носовой полости (0,012 г/мл)
< 5 кДа 2 2,5   0,5
5 — 30 кДа 1 2 1 1
> 30 кДа 3 3
Слизистая оболочка языка (0,1 г/мл)
< 5 кДа 1 1,5 1,5
5 — 30 кДа 1 1 2 2
> 30 кДа 3 4
Слизистая оболочка языка (0,05 г/мл)
> 30 кДа 1 2
Слизистая оболочка языка (0,025 г/мл)
< 5 кДа 1,5 1,5
5 — 30 кДа 1 1
> 30 кДа 5 5 2
Слизистая оболочка языка (0,012 г/мл)
> 30 кДа * 6
Слизистая оболочка ануса (0,1 г/мл)
5 — 30 кДа 1 2 2,5
Слизистая оболочка ануса (0,05 г/мл)
> 30 кДа 0,5 0,5
Слизистая оболочка ануса (0,025 г/мл)
< 5 кДа 3,5 3,5 3 3
5 — 30 кДа 2 2

*Намечается зона подавления роста

Выводы

Показано, чтоисследуемыеэкстракты слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, языка и прямой кишки являются многокомпонентными смесями, выявлены различные высокомолекулярные и низкомолекулярные соединения, при этом экстракты слизистых достаточно индивидуальны и, предположительно, включаютантимикробные пептиды.

Лиофилизаты, разведенные в различных концентрациях, подавляют рост Е. coliиP. Vulgaris, при этом, более интенсивное подавление роста наблюдается при использовании экстрактов слизистых ротовой, носовой полостей и языка в концентрации 0,1 г/мл. Стоит отметить, что подавление роста микроорганизма чаще заметно у экстрактов с молекулярными массами меньше 5 кДа и от 5 до 30 кДа.При этом отмечена разная направленность действия: выявлено менее выраженное антимикробное действие при использовании экстрактов слизистой оболочки ротовой полости (Е. coliиP. Vulgaris), носовой полости и языка (Р. Vulgaris).

Эти данные подтверждают предположение о наличии дефензинов в исследуемых экстрактах слизистых оболочек, теоретически способствующихболее быстрому ранозаживлению, уменьшению количества опухолевых клеток, стимулирующих ферментативную активность и обладающих широким спектром антибактериальной активности против различных грибковых и бактериальных патогенов.

Дальнейшие, более глубокие исследования экстрактов слизистых оболочек свиней и других сельскохозяйственных животных позволят более точно и детально изучить их действие в отношении живого организма, а так же патогенов грибковой и бактериальной природы.

Список литературы:

  1. Budikhina A.S. Defensins – multifunctional cations peptides of human/ Budikhina A.S., Pinegin B.V. // Immunopathology, allergology, infectology. 2008. – Vol.2, N 1. – P. 31–40.
  2. David G. Allison, Peter A. Lambert / Chapter 32 – Modes of Action of Antibacterial Agents // Molecular Medical Microbiology (Second Edition)2015, P. 583–598.
  3. Kirill A. Pluzhnikov. Linear antimicrobial peptides from Ectatommaquadridens ant venom/ Kirill A. Pluzhnikov, Sergey A. Kozlov, , Alexander A. Vassilevski, Olga V. Vorontsova, Alexei V. Feofanov, Eugene V. Grishin//Biochimie. – 2014. — Volume 107, Part B. – P. 211–215.
  4. Kris De Smet. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins / De S. Kris, C. Roland // Biotechnology Letters. – 2005. – Vol. 27, N 13.– 1337–1347.
  5. Protective effects of human milk antimicrobial peptides against bacterial infection / Anders P. Hakansson //Jornal de Pediatria (VersãoemPortuguês), — 2015. Volume 91, Issue 1, 4-5.
  6. Sebastian G.B. Amyes, Benjamin A. Evans / Chapter 33 – Molecular Epidemiology of Antibiotic Resistance in Humans and Animals // Molecular Medical Microbiology (Second Edition)2015, P. 599–609.
  7. Selsted M. E. Activity of rabbit leukocyte peptides against Candida albicans / M. E. Selsted, D. Szklarek, T. Ganz // Infect. Immun. – 1985. – Vol. 49, N 2. – P. 202–206.
  8. Selsted M. E. Purification and antibacterial activity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes / M. E. Selsted, D. Szklarek, R. I. Lehrer // Infect. Immun. – 1984. – Vol. 45, N 1. – P. 150–154.
  9. Protein Knowledgebase (UniProtKB), 2002-2014 [Электронныйресурс].URL: http://www.uniprot.org (Датаобращения03.2015).
    ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СЫРЬЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ
    Возможность выделения антимикробных пептидов из сырья животного происхождения и определения их антибактериальной активности микробиологическим методом в отношении Е. coliи P. vulgaris.
    Written by: Василевская Екатерина Романовна, Ертикеева Екатерина Александровна, Ахремко Анастасия Геннадьевна
    Published by: БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА
    Date Published: 02/23/2017
    Edition: ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_25.07.15_07(16)
    Available in: Ebook