29 Авг

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SYLVISTRIS L. НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ




Номер части:
Оглавление
Содержание
Журнал
Выходные данные


Науки и перечень статей вошедших в журнал:

Сохранение генетического разнообразия древесных растений возможно только при условии изучения популяционно-хорологической структуры вида и идентификации каждой элементарной популяции [1]. Основным критерием выделения популяций является специфика их генофондов [2], изучить которую можно с помощью методов молекулярно-генетического анализа.

Объектами исследований являлись четыре популяции Pinus sylvestris L. (Pinaceae), расположенные на востоке Русской Равнины: Ps_1 – в Ежихинском лесничестве Кировской области; Ps_2 – в Уренском лесничестве Нижегородской области; Ps_3 – в Коротнинском лесничестве Республики Марий Эл; Ps_4 – в Кокшайском лесничестве Республики Марий Эл.

Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса (S. Rogers) [3], модифицированный использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). Для проведения молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из свежих почек индивидуально у 46 деревьев каждой популяции. Навеска составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 184 проб ДНК с пятью праймерами посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для изучения генетической изменчивости популяций P. sylvestris амплифицировано 920 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США)  и выравнивали до 10 нг/мкл.

Для молекулярно-генетического анализа был избран ISSR-метод (Inter Simple Sequence Repeats, [4]). Он основан на использовании полимеразной цепной реакции с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеотида [4; 5] с достаточно высокой точностью отжига. ISSR-праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3′-конце праймера [5; 6].

Для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера , 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мM dNTP, 5мкл тотальной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; tо отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72ºС. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 до 64°С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).

В изученных популяциях Psylvestris выявлено 109 ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными. Доля полиморфных локусов (P95) в выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,826 до 0,950 и в среднем составила 0,879. Праймер (AGC)6C выявил самые низкие значения полиморфизма ISSR-PCR маркеров в популяциях, а праймер (АС)8T  – самые высокие (Таблица 1).

Доля полиморфных локусов (Р95) в изученных  популяциях варьировала от 0,474 до 0,679. Ожидаемая гетерозиготность (HE) в общей выборке составила 0,156. В популяции Ps_2 этот показатель минимальный (HE =0,101), а в популяции Ps_3 он максимальный – 0,217 (Таблица 2).

Таблица 1

Характеристика ISSRPCR маркеров четырех популяций P. sylvestris

ISSR-прай

меры

Нуклео

тидная

последо

ватель-

ность

(5’→ 3′)

Длина

ISSR-PCR марке

ров,

пн

Число ISSR- PCR маркеров в популяциях
Ps_1 Ps_2 Ps_3 Ps_4 На общую выборку
поли

морф

ных

поли

морф

ных

поли

морф

ных

поли

морф

ных

 

все

го

поли

морф

ных

IS1 (АС)8T 220-1115 6

(0,400)

6

(0,400)

11

(0,647)

12

(0,706)

20 19

(0,950)

CR212 (CT)8TG 250-1400 6

(0,462)

7

(0,412)

14

(0,824)

11

(0,733)

22 19

(0,864)

CR215 (CA)6GT 150-1280 7

(0,500)

8

(0,471)

12

(0,800)

11

(0,688)

20 18

(0,900)

M27 (GA)8C 150-1020 7

(0,438)

6

(0,462)

8

(0,500)

5

(0,385)

22 20

(0,909)

X10 (AGC)6C 200-1400 10

(0,556)

6

(0,400)

10

(0,625)

13

(0,813)

23 19

(0,826)

Всего (частота) 36

(0,474)

39

(0,506)

55

(0,679)

52

(0,675)

107 94

(0,879)

Примечание: в скобках указана доля полиморфных локусов  

 

Абсолютное число аллелей на локус (na) на общую выборку составило 1,953. Этот параметр наивысший в популяции Ps_3, в популяции Ps_1 он наименьший.

Таблица 2

Генетическая изменчивость четырех популяций P. sylvestris

Попу

ляция

Ps_1 0,102

(0,016)

1,355

(0,481)

1,167

(0,296)

3
Ps_2 0,101

(0,015)

1,365

(0,484)

1,157

(0,263)

2
Ps_3 0,217

(0,019)

1,589

(0,494)

1,370

(0,370)

2
Ps_4 0,206

(0,020)

1,533

(0,501)

1,362

(0,396)

0
На общую выборку 0,156

(0,002)

1,953

(0,212)

1,598

(0,360)

7

Примечание:  – ожидаемая гетерозиготность;  – абсолютное число аллелей на локус; -эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; – число редких ISSR-PCR маркеров, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов

Эффективное число аллелей на локус (ne) на общую выборку равно 1,598. Наибольшее значение этого параметра отмечено в популяции Ps_3, а наименьшее значение – в популяции Ps_2. Для характеристики генетической структуры популяций полезны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5% аллели. В Ps_1 выявлено наибольшее число уникальных ISSR-PCR маркеров – 3, характерных лишь для деревьев этой популяции. В Ps_2 и Ps_3 выявлено по 2 уникальных ISSR-PCR маркера. В Ps_4 не отмечены уникальные аллели (Таблица 2).

Анализ генетической структуры изученных четырех популяций показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) в среднем составила 0,338, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции (HS) равна 0,156; поэтому коэффициент генетической подразделенности популяций (GST) составил 0,537 (Таблица 3).

Таблица 3.

Генетическая структура и дифференциация четырех популяций P.  sylvestris

 

ISSR-

праймер

Нуклеотидная

последовательность

(5’→ 3′)

     
ISSR-1 (АС)8T 0,323 (0,026) 0,160 (0,011) 0,505
CR-212 (CT)8TG 0,323 (0,028) 0,159 (0,018) 0,509
CR-215 (CA)6GT 0,367 (0,026) 0,188 (0,024) 0,488
M27 (GA)8C 0,371 (0,032) 0,113 (0,019) 0,695
X10 (AGC)6C 0,306 (0,028) 0,165 (0,009) 0,462
Среднее 0,338 (0,028) 0,156 (0,016) 0,537

Примечание: HT – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; HS – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; GST – доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

На Урале так же были выявлены высокие показатели межпопуляционной изменчивости у Larix sibirica Ledeb. [7] и у Populus tremula L.[8]. Таким образом, изученные четыре популяции Psylvestris дифференцированы сильно, так как на долю межпопуляционного генетического разнообразия  приходится 53,7%.

Работа выполнена при частичном финансировании в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (проект144, № гос. рег. 01201461915) и гранта РФФИ (проект № 12- 04-00062-а).

 

Список литературы:

  1. Видякин А. И., Кантор Г.Я. Пространственная организация и факторы формирования групп популяций сосны обыкновенной в Южном Зауралье // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2013. – № 10. – С. 34-39.
  2. Тимофеев-Ресовский Н.В. Очерк учения о популяции / Н.В. Тимофеев-Ресовский, А.В. Яблоков, Н.В. Глотов – М.: Наука, 1973. – 278 с.
  3. Rogers S. O., Bendich A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. – – V. l, № 19. – P. 69-76.
  4. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. – – V. 20. – Р. 176-183.
  5. Boronnikova S.V., Kalendar R.N. Using IRAP markers for analisis of genetic variability in populations of resource and rare species of plants // Russian Jornal of Genetics. – – №1 (46). – P. 36- 42.
  6. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. – – № 18. – Р. 6531-6535.
  7. Нечаева Ю.С. С.В. Боронникова, А.И. Видякин и др. Молекулярно-генетический анализ популяций хвойных видов растений на Урале и востоке европейской части России для сохранения и возобновления лесных ресурсов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – – Т. 16. №1(3). – С. 878-882.
  8. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Нечаева Ю.С., Боронникова С.В. Генетическая дифференциация популяций Populus tremyla L. в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. – – №3 (95). – С. 11-13.
    ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SYLVISTRIS L. НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ
    В четырех изученных популяциях Pinus sylvestrys L. выявлено 107 ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными (P95 = 0,879). Ожидаемая гетерозиготность (HE) на общую выборку составила 0,156. Показатели генетического разнообразия выше в популяции, расположенной в Коротнинском лесничестве республики Марий Эл (P95 = 0,679; HE = 0,217; ne = 1,370), а самые низкие их значения отмечены в популяции в Уренском лесничестве Нижегородской области (P95 = 0,506; HE = 0,101; ne = 1,157). Анализ генетической структуры четырех популяций P. sylvestrys показал, что на межпопуляционную компоненту приходиться 53,7% генетического разнообразия.
    Written by: Пришнивская Яна Викторовна, Нечаева Юлия Сергеевна, Красильников Виталий Павлович, Мартыненко Никита Александрович
    Published by: БАСАРАНОВИЧ ЕКАТЕРИНА
    Date Published: 02/08/2017
    Edition: ЕВРАЗИЙСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ_29.08.15_08(17)
    Available in: Ebook